Этот метод позволяет визуализировать в режиме реального времени различные события, происходящие в костном мозге черепа мыши, такие как мегакариоциты, распространяющие проплацелеты внутри синусоидальных сосудов. Основным преимуществом данной методики является незначительная необходимая операция, минимизируя воспалительную реакцию, позволяющую in vivo визуализировать события в практически заводских условиях. Для начала переведите мышь в комнату визуализации.
Включите микроскоп и компьютер и настройте необходимые параметры. После того, как мышь полностью обезболена, поместите мышь на нагретую тарелку, нагретую до 37 градусов Цельсия для всех последующих манипуляций, побрейте голову и горло мыши и нанесите гель на глаза, чтобы предотвратить сухость. Поместите мышь на спину и зафиксируйте передние ноги хирургическим скотчем, чтобы растянуть горло.
После дезинфекции горла сделайте разрез от 0,7 до 1 сантиметра над правой или левой яремной веной ножницами и растяните соседнюю соединительную ткань, чтобы обнажить наружную вену жонглера поверх грудной мышцы. Заполните катетер теплым, стерильным физиологическим раствором. Проникните в катетер через грудную мышцу, а затем вставьте катетер в вену.
Аккуратно извлеките иглу, соедините шприц с флуоресцентными индикаторами и введите мертвый объем катетера. Поместите каплю хирургического клея для стабилизации катетера. Осторожно верните мышь в положение лежа.
Продезинфицируйте кожу головы 70% этанолом бумажным полотенцем, удалив распущенный волос. Используйте стерильные тонкие ножницы и пинцет, чтобы сделать Т-образный разрез на средней линии до одного сантиметра между ушами на коже головы, чтобы обнажить кальварий. Обнажите череп пинцетом, затем используйте ножницы и пинцет, чтобы аккуратно удалить позубицу.
Используйте стерильный ватный тампон, пропитанный физиологическим раствором, чтобы удалить всю надкостничную часть и любой мусор или волосы, которые могут изменить визуализацию. Промойте череп физиологическим раствором, чтобы удалить следы крови и быстро высушите кость ватным тампоном. Нанесите клеевой гель на кольцо, поместите кольцо на открытую кость и выдерживайте его в течение нескольких секунд, чтобы кольцо прочно прикрепило к черепу.
Слегка смочить череп солевым ватным тампоном. Приготовьте силиконовую зубную пасту, тщательно перемешав синие и желтые компоненты в соотношении один к одному. Запечатайте кольцо, нанеся зубную пасту, чтобы предотвратить утечку во время визуализации.
Осторожно удалите любую зубную пасту или клей, которые могли войти в кольцо. Затем заполните кольцо физиологическим раствором, чтобы проверить утечку. Поместите мышь на опору и положите сложенный компресс под голову животного, чтобы поднять голову и предотвратить отсоединение кольца от черепа при прикреплении к держателю.
Прикрутите кольцо к держателю блока. Поместите опору и мышь в камеру нагретого микроскопа. Установите соответствующие длины волн лазера для выбранных четырех четверок и восстановления излучаемых огней.
С помощью меж жонглерного катетера вводят 50 микролитров 0,2 микромолярной раствора флуоресцентного индикатора для маркировки сосудистой области. Поместите ступень микроскопа с опорой и мышью под цель микроскопа. Убедитесь, что кольцо всегда заполнено физиологическим раствором, и при необходимости наполните его, а также погрузите объектив и физиологический раствор.
Используйте эпифлуоресценцию, чтобы найти сосуды костного мозга и наблюдать мегакариоциты, выровненные вдоль синусоидальных сосудов. Для длительных захватов настройте 3D-захват пространства-времени с изображением 384 на 384 пикселя с использованием восьмикилометрового резонансного сканера и двунаправленного режима. Используйте усреднение строк с хорошим разрешением, затем выберите оптимизированный размер шага Z и настройте временной интервал, необходимый перед началом сбора.
Для коротких и быстрых снимков выберите пространство, тип захвата по времени и минимизируйте размер изображения. При необходимости отрегулируйте изображение к сосуду, поверните поле изображения. Используйте самую высокую доступную скорость сканирования и двунаправленное сканирование.
Сведите к минимуму усреднение линий, чтобы найти оптимальный компромисс между определением изображения и быстротой получения. Приобретите только один план Z и минимизируйте временной интервал для приобретения. Для измерения скорости тромбоцитов должно быть достаточно от 10 до 20 секунд приобретения.
Флуоресцентный индикатор вводили внутривенно для изображения анастомозированных синусоидных сосудов костного мозга в костном мозге черепа с направлением потока, изображенным стрелкой. Скорость флуоресцентных тромбоцитов регистрировалась в каждой ветви сосуда, и наблюдалась вариация. Синусоидальные сосуды представляют сложные потоки из-за анастомозов, с наличием окомования потока и даже стаза.
Стрелки указывали противоположное направление потока при бифуркации. Скорость тромбоцитов также измерялась для левой и правой ветвей сосудов, показанных на неравномерность с течением времени в каждой ветви сосуда с фазами ускорения, застоя и замедления. Наблюдались различные морфологии проплацетов, в том числе проплацетов с неправильными краями, затем затяжных проплатлетов и толстых и коротких проплателетов.
Когда мегакариоциты вытягивали проплацелеты в области сложных потоков, проплацелеты перекинулись из одной ветви сосуда в другую, в соответствии с направлением потока. После остановки кровотока проплацелеты расслаблялись и у мыши неожиданно произошла остановка сердца, что указывало на важность гидродинамических сил в проплателетном удлинении. Ширина и длина пластин также измерялись средней шириной 5,2 микрометра и наблюдалась средняя максимальная длина приблизительно 185 микрометров.
Построение длины проплатлета в качестве функции времени позволяет визуализировать поведение проплацет во время фаз удлинения, застоя или даже втягивания. Наблюдалась средняя скорость удлинения примерно 10 микрометров в минуту. Установка катетера, позволяла при инъекции препаратов изучать влияние на образование проплательных соединений или другие интересующие события в режиме реального времени.
