在维沃 小鼠头骨骨髓中巨细胞和前列腺的双光子成像

这种方法允许在不同事件的实时可视化，发生在头骨小鼠的骨髓中，如巨细胞，在鼻窦血管内延伸前列腺。这项技术的主要优点是需要一个小手术，以尽量减少炎症反应，允许在体内可视化的事件，在几乎工厂的条件。首先，将鼠标运送到成像室。

打开显微镜和计算机并设置所需的参数。一旦鼠标完全麻醉，将鼠标放在加热板上，加热至37摄氏度，用于所有以下操作，剃光鼠标的头部和喉咙，并将凝胶涂在眼睛上，以防止干燥。将鼠标放在其背上，用手术胶带固定前腿以伸展喉咙。

对喉咙进行消毒后，用剪刀在左右壶静脉上切开0.7至1厘米的切口，并伸展相邻的结缔组织，以暴露胸肌顶部的外侧杂耍静脉。用温暖、无菌的生理盐水填充导管。通过胸肌穿透导管，然后将导管插入静脉。

轻轻取出针头，将注射器与荧光示踪剂连接，并注射导管的死体积。放置一滴手术胶水以稳定导管。小心地将鼠标返回到易发位置。

用纸巾用70%乙醇消毒头皮，同时去除松动的头发。使用无菌细剪刀和钳子在头皮上的耳朵之间长达一厘米的中线进行 T 形切口，以暴露钙化物。用钳子露出头骨，然后用剪刀和钳子小心地取出腹膜。

使用浸泡的无菌棉签和生理盐水去除所有围产区以及任何可能改变成像的碎屑或头发。用盐水冲洗头骨，去除任何血迹，用棉签快速干燥骨头。将胶水凝胶涂抹在环上，将戒指放在裸露的骨头上并保持几秒钟，使戒指牢固地附着在头骨上。

用盐水编织棉签轻轻滋润头骨。通过以一对一的比例小心地混合蓝色和黄色组件来准备硅牙膏。使用牙膏密封环，以防止成像过程中泄漏。

小心地去除可能进入环的任何牙膏或胶水。然后用盐水填充环，以检查泄漏。将鼠标放在支架上，在动物头部下放置折叠压缩，以抬起头部，防止在连接到支架时将环从头骨分离。

拧紧块支架上的环。将支撑和鼠标组装放在加热显微镜室中。为所选的四个四点设置适当的激光波长，并恢复发射的光。

使用杂耍导管注射50微升0.2微摩尔溶液的荧光示踪剂，以标记血管。将显微镜阶段与支撑和鼠标置于显微镜的目标下。确保环始终充满盐水，并在需要时重新填充，并浸入目标和盐水。

使用表观来定位骨髓血管，并观察沿鼻窦血管对齐的巨型细胞。对于长期收购，使用 8 千克赫兹共振扫描仪和双向模式，使用 384 乘 384 像素图像设置 3D 时空采集。使用分辨率良好的平均线，然后选择优化的 Z 步大小，并在开始采集之前设置所需的时间间隔。

对于短期和快速的收购，请选择空间、时间获取类型，并最大限度地减少图像大小。如果需要，通过旋转成像场来调整图像到容器。使用最高可用的扫描速度和双向扫描。

最大限度地减少平均线，以找到图像定义和获取速度之间的最佳折衷点。只获取一个 Z 计划，并最大限度地缩短收购时间间隔。对于测量血小板速度 10 到 20 秒的采集应该足够。

荧光示踪剂通过静脉注射，以成像颅骨骨髓中的肛门骨髓窦状血管，箭头所描绘的流动方向。每个血管分支都记录了荧光血小板速度，并观察到变化。鼻窦血管由于肛门病而呈现复杂的流动，并存在流回流甚至停滞。

箭头指示了分叉时相反的流动方向。血小板速度也测量了左、右船枝，表明每个船枝的不规则性随时间推移，并具有加速、停滞和减速的阶段。观察到前列板的不同形态，包括边缘不规则的前列板，然后是渴望的前列板和厚而短的前列板。

当巨型卡约细胞在复杂流区域扩展导板时，根据流向，将导板从一个容器分支向另一个容器分支喷出。停止血流后，前列腺放松，小鼠意外地心脏骤停，表明水动力力在前列腺拉长中的重要性。还测量了前列板的宽度和长度，平均宽度为5.2微米，平均最大长度约为185微米。

将前列板长度绘制为时间函数，可以可视化在拉长、停滞甚至缩回阶段的前列板行为。观测到的平均拉长速度约为每分钟10微米。安装导管，允许注射药物实时研究对前列板形成或其他感兴趣的事件的影响。