Bu yöntem, kafatası faresinin kemik iliğinde gerçekleşen megakaryositler gibi, sinüzoid damarların içindeki proplateletleri genişleterek farklı olayların gerçek zamanlı olarak görselleştirilmesine izin verir. Bu tekniğin ana avantajı, enflamatuar reaksiyonu en aza indirmek için gereken küçük bir ameliyattır ve neredeyse fabrika koşullarında olayların in vivo bir şekilde görselleştirilmesine izin verir. Başlamak için fareyi görüntüleme odasına taşıyın.
Mikroskobu ve bilgisayarı aç ve gerekli parametreleri ayarla. Fare tamamen uyuşturulduktan sonra, fareyi aşağıdaki tüm manipülasyonlar için 37 santigrat dereceye kadar ısıtılmış ısıtılmış bir tabağa yerleştirin, farenin başını ve boğazını tıraş edin ve kuruluğu önlemek için jeli gözlere uygulayın. Fareyi sırtına yerleştirin ve boğazı germek için ön bacakları cerrahi bantla sabitleyin.
Boğazı dezenfekte ettikten sonra makas kullanarak sağ veya sol şah damarı üzerinde 0,7 ila 1 santimetrelik bir kesi yapın ve göğüs kasının üstündeki dış hokkabaz damarını ortaya çıkarmak için bitişik bağ dokusunu gerin. Kateteri ılık, steril fizyolojik salin ile doldurun. Kateteri pektoral kastan geçirin ve kateteri damara yerleştirin.
İğneyi yavaşça çıkarın, şırıngayı floresan izleyicilere bağlayın ve kateterin ölü hacmini enjekte edin. Kateteri stabilize etmek için bir damla cerrahi yapıştırıcı yerleştirin. Fareyi dikkatlice eğilimli bir konuma getirin.
Gevşek saçları çıkarırken kafa derisini kağıt havlu ile% 70 etanol ile dezenfekte edin. Calvarium'u ortaya çıkarmak için kafa derisindeki kulakların arasında bir santimetreye kadar orta çizgide T şeklinde bir kesi yapmak için steril ince makas ve cımbız kullanın. Kafatasını cımbızla açığa çıkarın, ardından periosteumu dikkatlice çıkarmak için makas ve cımbız kullanın.
Tüm periosteumu ve görüntülemeyi değiştirebilecek herhangi bir döküntüyü veya saçı çıkarmak için steril bir pamuklu çubuk ve fizyolojik salin kullanın. Kan izlerini gidermek için kafatasını salinle durulayın ve kemiği bir pamuklu çubukla hızla kurulayın. Tutkal jelini halkaya uygulayın, halkayı açıkta kalan kemiğe yerleştirin ve halkanın kafatasına sıkıca yapışmasını sağlamak için birkaç saniye saklayın.
Kafatasını tuzlu bir pamuklu çubukla hafifçe nemlendirin. Mavi ve sarı bileşenleri bire bir oranında dikkatlice karıştırarak Silikon diş macunu hazırlayın. Görüntüleme sırasında sızıntıyı önlemek için diş macunu uygulayarak halkayı kapatın.
Halkaya girmiş olabilecek herhangi bir diş macunu veya yapıştırıcıyı dikkatlice çıkarın. Daha sonra sızıntıyı kontrol etmek için halkayı salinle doldurun. Fareyi desteğin üzerine yerleştirin ve başı kaldırmak ve tutucuya bağlandığında yüzüğün kafatasından kopmasını önlemek için hayvanın başının altına katlanmış bir kompres koyun.
Yüzüğü blok tutucusuna vidala. Destek ve fare tertibatını ısıtılmış mikroskop haznesine yerleştirin. Seçilen dört dörtlü için uygun lazer dalga boylarını ayarlayın ve yayılan ışıkların geri kazanılması.
Inter hokkabaz kateteri kullanarak, vaskülatörü etiketlemek için floresan izleyicinin 0,2 mikromolar çözeltisinin 50 mikrolitresini enjekte edin. Mikroskop aşamasını destek ve fare ile mikroskop hedefinin altına yerleştirin. Yüzüğün her zaman tuzlu suyla dolduğundan emin olun ve gerekirse yeniden doldurun ve hedefi ve salini daldırin.
Kemik iliği damarlarını bulmak ve sinüzoid damarlar boyunca hizalanmış megakaryositleri gözlemlemek için epifluoresans kullanın. Uzun satın almalar için, sekiz kiloluk Hertz rezonans tarayıcısı ve çift yönlü mod kullanarak 384 x 384 piksel görüntü ile 3D uzay-zaman kazanımı ayarlayın. İyi çözünürlükte hat ortalamasını kullanın, ardından optimize edilmiş Z adım boyutunu seçin ve alıma başlamadan önce gereken zaman aralığını ayarlayın.
Kısa ve hızlı alımlar için bir alan, zaman alma türü seçin ve görüntü boyutunu en aza indirin. Gerekirse, görüntüleme alanını döndürerek görüntüyü damara ayarlayın. Mevcut en yüksek tarama hızını ve çift yönlü taramayı kullanın.
Görüntü tanımı ve alımın hızlılığı arasındaki en uygun uzlaşmayı bulmak için çizgi ortalamasını en aza indirin. Yalnızca bir Z planı alın ve edinme için zaman aralığını en aza indirin. Trombosit hızını ölçmek için 10 ila 20 saniye alım yeterli olmalıdır.
Floresan izleyici, kafatası kemik iliğindeki anastomoz ilik sinüzoid damarlarını, okla gösterilen akış yönüyle görüntülemek için intravenöz olarak uygulandı. Floresan trombosit hızı her gemi dalında kaydedildi ve varyasyon gözlendi. Sinüzoid damarlar, akış yeniden akışı ve hatta durağanlık varlığı ile anastomozlar nedeniyle karmaşık akışlar sunar.
Oklar çatallanmada tam tersi akış yönünü gösteriyordu. Trombosit hızı da sol ve sağ damar dalları için ölçüldü hızlanma, durağanlık ve yavaşlama evreleri ile her damar dalında zaman içinde düzensizlik olduğu belirtildi. Düzensiz kenar boşluklu proplateletler, daha sonra uzun süreli proplateletler ve kalın ve kısa proplateletler dahil olmak üzere farklı proplatelet morfolojileri gözlendi.
Megakaryositler karmaşık akış alanlarındaki proplateletleri genişlettiğinde, proplateletler akış yönüne göre bir damar dalından diğerine atılmıştır. Kan akışını durdurduktan sonra, proplateletler gevşedi ve fare beklenmedik bir şekilde kalp krizi geçirdi, proplatelet uzamasında hidrodinamik kuvvetlerin önemini gösterdi. Proplatletlerin genişliği ve uzunluğu da ortalama 5,2 mikrometre genişlik ölçtü ve ortalama maksimal uzunluk yaklaşık 185 mikrometre gözlendi.
Proplatlet uzunluğunu zamanın bir işlevi olarak çizmek, uzama, durağanlık ve hatta geri çekme aşamalarında proplateletlerin davranışının görselleştirilmesine izin verir. Dakikada yaklaşık 10 mikrometre ortalama uzama hızı gözlendi. Kateterin montajı, ilaçların enjeksiyonunun proplatlet oluşumu veya diğer ilgi çekici olaylar üzerindeki etkilerini gerçek zamanlı olarak incelemesine izin verildi.
