이 방법은 거대 카르요사이클과 같은 두개골 마우스의 골수에서 일어나는 다양한 사건의 실시간으로 시각화를 허용하고, 부비동성 혈관 내부의 프로플라틀을 확장한다. 이 기술의 주요 장점은 염증 반응을 최소화하는 데 필요한 경미한 수술로 거의 공장 조건에서 이벤트의 생체 내 시각화를 허용합니다. 먼저 마우스를 이미징 룸으로 전송합니다.
현미경 및 컴퓨터를 켜고 필요한 매개 변수를 설정합니다. 마우스가 완전히 마취되면 가열 된 접시에 마우스를 놓고 다음 조작을 위해 섭씨 37도까지 따뜻하게하고 마우스의 머리와 목을 면도하고 건조를 방지하기 위해 젤을 눈에 적용하십시오. 마우스를 등에 놓고 수술 용 테이프로 앞쪽 다리를 고정하여 목을 늘립니다.
목을 소독 한 후, 가위를 사용하여 오른쪽 또는 왼쪽 경정맥에 0.7 ~ 1 센티미터 절개를하고 가슴 근육 의 상단에 외부 저글러 정맥을 노출하기 위해 인접한 결합 조직을 스트레칭. 카테터를 따뜻하고 멸균된 생리식염수로 채웁니다. 가슴 근육을 통해 카테터를 관통한 다음 카테터를 정맥에 삽입합니다.
바늘을 부드럽게 제거하고 주사기를 형광 추적자와 연결하고 카테터의 죽은 부피를 주입합니다. 카테터를 안정시키기 위해 수술 접착제 한 방울을 놓습니다. 마우스를 조심스럽게 쉬운 위치로 되돌려 놓습니다.
느슨한 머리를 제거하는 동안 종이 타월로 70 %의 에탄올로 두피를 소독하십시오. 멸균 미세 가위와 핀셋을 사용하여 두피의 귀 사이에 최대 1센티미터의 미드라인에서 T자형 절개를 하여 칼바륨을 노출시합니다. 핀셋으로 두개골을 노출한 다음 가위와 핀셋을 사용하여 골막을 조심스럽게 제거합니다.
멸균 면봉에 담그고 생리식염수에 사용하여 모든 폐막염과 이미징을 바꿀 수 있는 파편이나 머리카락을 제거하십시오. 두개골을 식염수로 헹구고 혈액 흔적을 제거하고 면봉으로 뼈를 빠르게 건조시다. 접착제 젤을 반지에 바르고, 노출된 뼈에 링을 놓고 몇 초 동안 유지하여 반지가 두개골에 단단히 부착되도록 합니다.
살린 웨드 코튼 면봉으로 두개골을 가볍게 촉촉하게 합니다. 일대일 비율로 파란색과 노란색 성분을 조심스럽게 혼합하여 실리콘 치과 페이스트를 준비합니다. 이미징 중 누출을 방지하기 위해 치과 페이스트를 적용하여 링을 밀봉하십시오.
고리에 들어갔을 수 있는 치과 페이스트 나 접착제를 조심스럽게 제거하십시오. 그런 다음 새는 것을 확인하기 위해 식염수로 링을 채웁니다. 마우스를 지지에 놓고 동물의 머리 아래에 접힌 압축을 넣어 머리를 들어 올리고 홀더에 부착할 때 두개골에서 반지의 분리를 방지합니다.
블록 홀더에 링을 나사로 표시합니다. 가열된 현미경 챔버에 지지체 및 마우스 어셈블리를 배치합니다. 선택한 4개의 포스에 적합한 레이저 파장을 설정하고 방출된 조명의 복구를 설정합니다.
인터 저글러 카테터를 사용하여 형광 추적기의 0.2 마이크로몰라 용액 50 마이크로리터를 주입하여 혈관에 라벨을 부착합니다. 현미경의 목적하에 지지체와 마우스로 현미경 단계를 배치합니다. 링이 항상 식염수로 채워져 있는지 확인하고 필요한 경우 리필하고 목표와 식염수에 침지하십시오.
골수 혈관을 찾아 부비동산 혈관을 따라 정렬 된 거대 카르요낭을 관찰하기 위해 epifluorescence를 사용합니다. 긴 획득을 위해 8킬로 헤르츠 공명 스캐너와 양방향 모드를 사용하여 384 x 384 픽셀 이미지로 3D 시공간 인수를 설정합니다. 좋은 해상도로 라인 평균을 사용한 다음 최적화된 Z 단계 크기를 선택하고 인수를 시작하기 전에 필요한 시간 간격을 설정합니다.
짧고 빠른 인수를 위해 공간, 시간 획득 유형을 선택하고 이미지 크기를 최소화합니다. 필요한 경우 이미징 필드를 회전하여 이미지를 용기에 조정합니다. 사용 가능한 가장 높은 스캐닝 속도와 양방향 스캐닝을 사용합니다.
이미지 정의와 수집의 급속성 사이의 최적의 타협을 찾기 위해 라인 평균을 최소화합니다. Z 플랜을 하나만 획득하고 획득 시시간을 최소화합니다. 혈소판 속도를 측정하기 위해 10~ 20초의 획득이 충분해야 한다.
형광 추적자는 두개골 골수의 해부학 된 골수 부비동성 혈관을 이미지하기 위해 정맥 투여되었으며 화살표에 의해 묘사 된 유동 방향. 형광 혈소판 속도는 각 혈관 분기에 기록되었고, 변이가 관찰되었다. 부비동성 혈관은 마취로 인해 복잡한 흐름을 제시하며, 흐름 리플로우와 정지도 존재합니다.
화살표는 분기에서 흐름의 반대 방향을 나타냈다. 혈소판 속도는 또한 가속, 정지 및 감속의 단계와 각 혈관 지점에서 시간이 지남에 따라 불규칙성을 표시 왼쪽 및 오른쪽 혈관 지점에 대해 측정되었다. 프로 플라츠탄의 다른 형태가 관찰되었다, 불규칙한 마진과 프로 플라판판을 포함, 다음 갈망 프로 플라틀렛과 두껍고 짧은 proplatelets.
메가카요세포가 복잡한 흐름 영역에서 프로플라츠를 확장했을 때, 유동 방향에 따라 한 용기 지점에서 다른 혈관 분지로 배혈소판이 던졌다. 혈류를 멈추면 프로플라소판이 완화되고 마우스가 예기치 않게 심장 마비를 겪었으며, 연막 신장에서 유체 역학력의 중요성을 지적했습니다. 프로플라츠의 폭과 길이도 평균 폭 5.2 마이크로미터를 측정하고 평균 최대 길이약 185 마이크로미터가 관찰되었다.
프로플라츠보 길이를 시간의 함수로 플로팅하면 신장, 정지 또는 후퇴 단계 동안 프로플라츠의 동작을 시각화할 수 있습니다. 분당 약 10 마이크로미터의 평균 신장 속도가 관찰되었다. 카테터의 설치, 프로 플라틀렛 형성 또는 실시간으로 관심의 다른 이벤트에 미치는 영향을 연구 하는 약물의 주입을 허용.
