Diese Methode ermöglicht die Visualisierung verschiedener Ereignisse, die im Knochenmark der Schädelmaus stattfinden, wie Megakaryozyten, die Sich ausschildern und Pro thrombozyten innerhalb der Sinusgefäße ausdehnen. Der Hauptvorteil dieser Technik ist eine kleine Operation, die erforderlich ist, um die Entzündungsreaktion zu minimieren, was eine In-vivo-Visualisierung von Ereignissen unter den fast fabrikseitigen Bedingungen ermöglicht. Transportieren Sie zunächst die Maus in den Bildraum.
Schalten Sie Mikroskop und Computer ein und richten Sie die erforderlichen Parameter ein. Sobald die Maus vollständig betäubt ist, legen Sie die Maus auf eine beheizte Platte, die für alle folgenden Manipulationen auf 37 Grad Celsius erwärmt wird, rasieren Sie den Kopf und den Hals der Maus und tragen Sie das Gel auf die Augen auf, um Trockenheit zu verhindern. Legen Sie die Maus auf den Rücken und fixieren Sie die vorderen Beine mit chirurgischem Klebeband, um den Hals zu dehnen.
Nach der Desinfektion des Rachens mit einer Schere einen Schnitt von 0,7 bis 1 Zentimeter über die rechte oder linke Jugularvene machen und das angrenzende Bindegewebe dehnen, um die äußere Jongliervene auf dem Brustmuskel freizulegen. Füllen Sie den Katheter mit warmer, steriler physiologischer Kochsalzlösung. Dringen Sie in den Katheter durch den Brustmuskel ein und führen Sie den Katheter dann in die Vene ein.
Entfernen Sie vorsichtig die Nadel, verbinden Sie die Spritze mit den fluoreszierenden Tracern und injizieren Sie das Totvolumen des Katheters. Legen Sie einen Tropfen chirurgischen Klebers, um den Katheter zu stabilisieren. Bringen Sie die Maus vorsichtig in eine Bauchlage zurück.
Desinfizieren Sie die Kopfhaut mit 70% Ethanol mit einem Papiertuch, während Sie die losen Haare entfernen. Verwenden Sie sterile feine Scheren und Pinzetten, um einen T-förmigen Schnitt an der Mittellinie bis zu einem Zentimeter zwischen den Ohren auf der Kopfhaut zu machen, um das Kalvarium freizulegen. Legen Sie den Schädel mit einer Pinzette frei, dann verwenden Sie Schere und Pinzette, um das Periost vorsichtig zu entfernen.
Verwenden Sie einen sterilen Wattestäbchen getränkt und physiologische Kochsalzlösung, um das gesamte Periost und alle Ablagerungen oder Haare zu entfernen, die die Bildgebung verändern könnten. Spülen Sie den Schädel mit Kochsalzlösung ab, um Blutspuren zu entfernen, und trocknen Sie den Knochen schnell mit einem Wattestäbchen ab. Tragen Sie das Klebegel auf den Ring auf, legen Sie den Ring auf den freiliegenden Knochen und halten Sie ihn einige Sekunden lang, damit der Ring fest am Schädel befestigt werden kann.
Befeuchten Sie den Schädel leicht mit einem salzhaltigen Wattestäbchen. Bereiten Sie die Silizium-Dentalpaste vor, indem Sie die blauen und gelben Komponenten vorsichtig im Verhältnis eins zu eins mischen. Versiegeln Sie den Ring, indem Sie die Zahnpaste auftragen, um ein Auslaufen während der Bildgebung zu verhindern.
Entfernen Sie vorsichtig alle Zahnpasten oder Klebstoffe, die möglicherweise in den Ring gelangt sind. Dann füllen Sie den Ring mit Kochsalzlösung, um die Leckage zu überprüfen. Legen Sie die Maus auf die Stütze und legen Sie eine gefaltete Kompresse unter den Kopf des Tieres, um den Kopf anzuheben und zu verhindern, dass sich der Ring vom Schädel löst, wenn er am Halter befestigt wird.
Schrauben Sie den Ring an den Blockhalter. Legen Sie die Stütze und die Mausmontage in die beheizte Mikroskopkammer. Stellen Sie die entsprechenden Laserwellenlängen für die ausgewählten vier Vierer und die Rückgewinnung der emittierten Lichter ein.
Mit dem Interjongleurkatheter injizieren Sie 50 Mikroliter 0,2 Mikromolarlösung des fluoreszierenden Tracers, um das Gefäß zu kennzeichnen. Platzieren Sie den Mikroskopstand mit der Unterstützung und maus unter das Objektiv des Mikroskops. Stellen Sie sicher, dass der Ring immer mit Kochsalzlösung gefüllt ist und füllen Sie ihn bei Bedarf auf, und tauchen Sie das Ziel und die Kochsalzlösung ein.
Verwenden Sie Epifluoreszenz, um die Knochenmarkgefäße zu lokalisieren und die Megakaryozyten entlang der sinusförmigen Gefäße auszurichten. Richten Sie für lange Aufnahmen eine 3D-Raum-Zeit-Erfassung mit einem 384 x 384 Pixel großen Bild mit einem Acht-Kilo-Hertz-Resonanzscanner und einem bidirektionalen Modus ein. Verwenden Sie die Zeilenmittelung mit guter Auflösung, wählen Sie dann die optimierte Z-Schrittgröße und richten Sie das erforderliche Zeitintervall ein, bevor Sie mit der Erfassung beginnen.
Wählen Sie für kurze und schnelle Aufnahmen einen Raum- und Zeiterfassungstyp und minimieren Sie die Bildgröße. Passen Sie das Bild bei Bedarf an das Gefäß an, indem Sie das Bildfeld drehen. Verwenden Sie die höchste verfügbare Scangeschwindigkeit und bidirektionales Scannen.
Minimieren Sie die Mittelwertbildung der Linie, um den optimalen Kompromiss zwischen Bilddefinition und Geschwindigkeit der Aufnahme zu finden. Erwerben Sie nur einen Z-Plan und minimieren Sie das Zeitintervall für die Erfassung. Für die Messung der Thrombozytengeschwindigkeit sollten 10 bis 20 Sekunden Erfassung ausreichen.
Der fluoreszierende Tracer wurde intravenös verabreicht, um die anastomosierten Sinusgefäße des Markes im Schädelknochenmark abzubilden, wobei die Fließrichtung durch den Pfeil dargestellt wurde. Die fluoreszierende Thrombozytengeschwindigkeit wurde in jedem Gefäßzweig aufgezeichnet und Variationen wurden beobachtet. Die sinusförmigen Gefäße präsentieren aufgrund der Anastomosen komplexe Strömungen, mit dem Vorhandensein von Strömungsrückfluss und sogar Stasis.
Pfeile zeigten die entgegengesetzte Strömungsrichtung an der Verzweigung an. Die Thrombozytengeschwindigkeit wurde auch für linke und rechte Gefäßäste gemessen, die im Laufe der Zeit in jedem Gefäßzweig mit Phasen der Beschleunigung, Stasis und Verzögerung Unregelmäßigkeiten anzeigten. Verschiedene Morphologien von Proplättchen wurden beobachtet, darunter Proplättchen mit unregelmäßigen Rändern, dann lange Proplättchen und dicke und kurze Proplättchen.
Wenn Megakaryozyten die Proplättchen in den Bereichen komplexer Strömungen ausdehnen, wurden die Proplättchen entsprechend der Strömungsrichtung von einem Gefäßzweig zum anderen gewächsigt. Nach dem Stoppen des Blutflusses entspannten sich die Blutplättchen und die Maus erlitt unerwartet einen Herzstillstand, was auf die Bedeutung hydrodynamischer Kräfte bei der Pro thrombozytendehnung hindeutet. Die Breite und Länge der Proplättchen wurde ebenfalls mit einer mittleren Breite von 5,2 Mikrometern gemessen und eine mittlere maximale Länge von etwa 185 Mikrometern beobachtet.
Die Darstellung der Prothrombozytenlänge als Funktion der Zeit ermöglicht die Visualisierung des Verhaltens von Proplättchen während Phasen der Dehnung, Stase oder sogar des Rückzugs. Die mittlere Dehnungsgeschwindigkeit von etwa 10 Mikrometern pro Minute wurde beobachtet. Die Installation des Katheters ermöglichte die Injektion von Medikamenten, um die Auswirkungen auf die Thrombozytenbildung oder andere interessante Ereignisse in Echtzeit zu untersuchen.
