Многие геннотерапевтические и нейронаучные исследования включают инъекции векторов AAV в мозг нечеловеческих приматов. Чтобы эти исследования были успешными, техника инъекций должна быть надежной. Наша техника инъекций мгновенна и точна.
Эта процедура хорошо работает для инъекций анестезированным или бодрствующим животным. Наша домашняя канюля проста в обращении и недорога. Продемонстрировать процедуру будет Кевин Май, инженер-техник из моей лаборатории.
Для начала притупить 13-миллиметровый наконечник подкожной иглы 30-миллиметрового калибра дисковой шлифовальной машиной. Затем вырежьте кусок трубки из нержавеющей стали на длину в зависимости от глубины целевой области мозга. С помощью дисковой шлифовальной машины скосите один конец разрезанной трубки и сгладьте другой.
Снимите заусенцы с внутренней части трубки с помощью протяжки. Затем нарежьте кусок трубки из PTFE на длину, соответствующую объему векторного раствора, подлежащего загрузке. Вспыхните оба конца трубки, вставив притупленную подкожную иглу.
Вставьте притупленную подкожную иглу примерно на пять миллиметров в один конец трубки из PTFE. Затем вставьте скошенный конец трубки из нержавеющей стали примерно на пять миллиметров в другой конец. Проверьте канюлю, введя фильтрованную воду через подкожную иглу.
Убедитесь, что вода выходит из скошенного наконечника трубки из нержавеющей стали плавно и что вода не вытекает ни из одного соединения. После тестирования канюли поместите ее в автоклавный мешок и стерилизуйте автоклавом. Аккуратно переложите векторный раствор в стерилизованную ПЦР-трубку с пипеткой Р-20, избегая образования пузырьков.
Затем прикрепите канюлю скошенным наконечником, обращенным вниз, к вертикально ориентированному стереотаксическому держателю. Затем подключите одномиллилитровой шприц luer lock к подкожной игольчатой ступице канюли. Погрузите скошенный наконечник в векторный раствор.
Затем нанесите мягкое отрицательное давление с помощью одномиллилитрового шприца, чтобы загрузить раствор в канюлю, визуально отслеживая мениск между раствором и воздухом. После того, как векторный раствор был загружен, продолжайте мягкое отрицательное давление до тех пор, пока раствор не достигнет ступицы иглы. Затем снимите шприц в один миллилитр и медленно введите цветное минеральное масло вдоль внутренней стенки подкожной иглы, заботясь о том, чтобы избежать пузырьков воздуха.
Прикрепите ступичку иглы для подкожных инъекций к одному из двух открытых портов трехходового стопорного крана luer lock. Затем закройте порт. Наполните одномиллилитровой шприц воздухом и прикрепите его к любому из двух других портов.
Наконец, закройте оставшийся порт запорного крана, чтобы соединить шприц с канюлей. Прикрепление шприца вдавливает воздух в запорный кран и шунтирование этого воздуха в незанятый порт не позволяет ему толкать векторный раствор обратно вниз по канюле. Медленно выталкивайте воздух из шприца в канюлю.
Как только окрашенное масло появится на кончике тупой иглы в трубке из PTFE, проверьте наличие воздуха между раствором и цветным маслом. Продолжайте оказывать положительное давление до тех пор, пока капля векторного раствора не будет видна на кончике скошенной канюли. Затем закройте запорный кран, чтобы предотвратить выход вектора из канюли под действием силы тяжести.
После загрузки векторного решения прикрепите канюлю к стереотаксическому манипулятору. Затем, чтобы подключить запорный кран к электрическому воздушному насосу, возьмите трубку насоса у нестерильного помощника. Прохватите разъем замка luer через стенку стерильной втулки.
Опустите воротник рукава, позволив ему простираться вдоль трубки под действием силы тяжести. Затем прикрепите стопор и плотно заклейте втулку вокруг разъема замка luer. Затем протестируйте воздушный насос и канюлю, установив воздушный насос на низкое давление, прежде чем включить его и увеличить давление, пока масло не пройдет через канюлю и капля векторного раствора не будет видна на кончике канюли.
Прикрепите пластиковую линейку к трубке из PTFE для измерения движения мениска во время инъекции. Затем опустите канюлю вниз с помощью стереотаксического манипулятора, пока наконечник не достигнет поверхности, и запишите глубину. Отведите канюлю к самому глубокому месту, которое будет введено вдоль дорожки.
Поверхность будет ямочиться при контакте. Чтобы свести к минимуму неправильное нацеливание из-за сжатия тканей, опустите канюлю вниз и превысите самое глубокое место инъекции на 500 микрометров. Затем медленно втягивайтесь.
Другими альтернативами являются медленное движение канюли вниз или быстрое вождение и ожидание внизу от одной до пяти минут. Как только канюля будет расположена в самом глубоком месте инъекции, используйте электрический воздушный насос для впрыска 0,5 микролитра векторного раствора в течение 10-30 секунд. Подтвердите поток инъекции, отслеживая мениск между цветным маслом и векторным раствором в трубке PTFE.
Подождав одну минуту, втяните канюлю к следующему месту инъекции по дорожке. После последней инъекции оставьте канюлю на месте в течение 10 минут, чтобы избежать векторного эффлюкса. Затем втяните канюлю и выбросьте ее в контейнер с биологической опасностью.
Инъекция векторов AAV, несущих трансген канала родопсина II в левый верхний колликулус, с последующей стимуляцией непрерывным синим светом в 40 милливатт, произвела серию последовательных потенциалов действия. Световые импульсы в одну миллисекунду не смогли вызвать потенциалы действия в 40 милливатт, но надежно вызывали их при 160 милливаттах. Оптическая стимуляция верхнего колликулуса, вызванная визуально управляемыми саккадами, постепенно уменьшала прирост саккады.
Медленность этого изменения согласуется с оптогенетически индуцированной пластичностью. Доставка желтого лазерного света к глазодвигательному вермису после инъекций AAV в ядро reticularis tegmentae pontis подавляет активность мшистого волокна, которое является входом в мозжечок. Это подавление снижало активность клеток Пуркинье, которые являются выходом мозжечка.
Во время оптогенетического подавления скорость срабатывания уменьшалась и изменялась на паттерн разрыва пор, предполагая, что ингибированное мшистое волокно, входящее в клетки Пуркинье, влияет на фазу замедления саккады, приводя во второй всплеск. Канальный родопсин экспрессировался исключительно в клетках Пуркинье глазодвигательного вермиса. Доставка коротких световых импульсов увеличивала простую пиковую активность изолированной клетки Пуркинье.
Один световой импульс в 1,5 миллисекунды часто вызывал более одного простого всплеска. Оптогенетическая простая активация шипов, приуроченная к возникновению во время саккады, увеличивает амплитуду саккады, подтверждая дезингибиторную роль клеток Пуркинье в генераторе глазодвигательных всплесков. Пузырьки воздуха в канюле могут нарушить работу масляного вектора мениска, усложнить определение объемов впрыска и предотвратить тонкий контроль скорости потока.
По этим причинам загрузка векторных растворов без пузырьков воздуха имеет решающее значение для этой процедуры. Через шесть-восемь недель после инъекции могут быть выполнены оптогенетические манипуляции и ткань мозга может быть обработана для гистологического анализа. Этот метод позволяет исследователям тестировать множество векторов на нескольких животных, что, в свою очередь, облегчает разработку и валидацию новых векторов.
Особая область, представляющая интерес в настоящее время, заключается в разработке векторов, которые будут нацелены на конкретные типы нейронов.
