De nombreuses études géniques thérapeutiques et neuroscientifiques impliquent des injections de vecteurs AAV dans le cerveau de primates non humains. Pour que ces études soient couronnées de succès, la technique d’injection doit être fiable. Notre technique d’injection est instantanée et précise.
Cette procédure fonctionne bien pour l’injection chez les animaux anesthésiés ou éveillés. Notre canule maison est facile à manipuler et peu coûteuse. La procédure sera présentée par Kevin Mai, un technicien en ingénierie de mon laboratoire.
Pour commencer, émoussez une pointe d’aiguille hypodermique de calibre 30 de 13 millimètres avec une meuleuse à disque. Ensuite, coupez un morceau de tube en acier inoxydable à une longueur en fonction de la profondeur de la zone cérébrale cible. À l’aide d’une meuleuse à disques, biseauter une extrémité du tube coupé et lisser l’autre.
Ébavure l’intérieur du tube avec une broche. Ensuite, coupez un morceau de tube en PTFE à une longueur appropriée pour le volume de solution vectorielle à charger. Évasez les deux extrémités du tube en insérant l’aiguille hypodermique émoussée.
Insérez l’aiguille hypodermique émoussée d’environ cinq millimètres dans une extrémité du tube PTFE. Insérez ensuite l’extrémité non biseautée du tube en acier inoxydable d’environ cinq millimètres dans l’autre extrémité. Testez la canule en injectant de l’eau filtrée à travers le moyeu hypodermique de l’aiguille.
Confirmer que l’eau sort doucement de l’embout du tube en acier inoxydable biseauté et que l’eau ne fuit pas de l’un ou l’autre jonction. Après avoir testé la canule, placez-la dans un sac autoclave et stérilisez-la par autoclavage. Transférer doucement la solution vectorielle dans un tube de PCR stérilisé à l’aide d’un pipetter P-20, en évitant la formation de bulles.
Ensuite, fixez la canule avec la pointe biseautée vers le bas à un support stéréotaxique orienté verticalement. Ensuite, connectez une seringue Luer Lock d’un millilitre au moyeu d’aiguille hypodermique de la canule. Immergez la pointe biseautée dans la solution vectorielle.
Ensuite, appliquez une légère pression négative avec la seringue d’un millilitre pour charger la solution dans la canule tout en suivant visuellement le ménisque entre la solution et l’air. Une fois la solution vectorielle chargée, continuez la légère pression négative jusqu’à ce que la solution atteigne le moyeu de l’aiguille. Ensuite, retirez la seringue d’un millilitre et injectez lentement de l’huile minérale colorée le long de la paroi interne du moyeu de l’aiguille hypodermique, en prenant soin d’éviter les bulles d’air.
Fixez le moyeu d’aiguille hypodermique à l’un des deux orifices ouverts d’un robinet d’arrêt de verrouillage luer à trois voies. Ensuite, fermez le port. Remplissez une seringue d’un millilitre avec de l’air et fixez-la à l’un des deux autres ports.
Enfin, fermez l’orifice restant du robinet d’arrêt pour connecter la seringue à la canule. La fixation de la seringue force l’air dans le robinet d’arrêt et la manœuvre de cet air vers l’orifice inoccupé l’empêche de repousser la solution vectorielle vers le bas de la canule. Poussez lentement l’air de la seringue dans la canule.
Une fois que l’huile colorée apparaît à l’extrémité de l’aiguille émoussée dans le tube en PTFE, vérifiez la présence d’air entre la solution et l’huile colorée. Continuez à appliquer une pression positive jusqu’à ce qu’une goutte de solution vectorielle soit visible à l’extrémité de la canule biseautée. Ensuite, fermez le robinet d’arrêt pour empêcher le vecteur de sortir de la canule par gravité.
Une fois la solution vectorielle chargée, fixez la canule au manipulateur stéréotaxique. Ensuite, pour connecter le robinet d’arrêt à la pompe à air électrique, prenez le tuyau de la pompe de l’assistant non stérile. Saisissez le connecteur Luer Lock à travers la paroi d’un manchon stérile.
Laissez tomber le collier du manchon, lui permettant de s’étendre le long du tube par gravité. Ensuite, fixez le robinet d’arrêt et collez fermement le manchon autour du connecteur de verrouillage luer. Ensuite, testez la pompe à air et la canule en réglant la pompe à air à basse pression, avant de l’allumer et d’augmenter la pression jusqu’à ce que l’huile avance à travers la canule et qu’une goutte de solution vectorielle soit visible à l’extrémité de la canule.
Collez une règle en plastique sur le tube en PTFE pour mesurer le mouvement du ménisque pendant l’injection. Ensuite, enfoncez la canule vers le bas avec le manipulateur stéréotaxique jusqu’à ce que la pointe atteigne la surface et enregistrez la profondeur. Conduire la canule au site le plus profond pour être injectée le long de la piste.
La surface tombera au contact. Pour minimiser les erreurs de ciblage dues à la compression tissulaire, abaissez la canule et dépassez de 500 micromètres le site d’injection le plus profond. Ensuite, rétractez lentement.
D’autres alternatives sont de faire descendre la canule lentement ou de la conduire rapidement et d’attendre au fond pendant une à cinq minutes. Une fois la canule positionnée au site d’injection le plus profond, utilisez la pompe à air électrique pour injecter 0,5 microlitre de la solution vectorielle en 10 à 30 secondes. Confirmer le débit d’injection en suivant le ménisque entre l’huile colorée et la solution vectorielle dans le tube PTFE.
Après avoir attendu une minute, rétractez la canule au site d’injection suivant le long de la piste. Après l’injection finale, laissez la canule en place pendant 10 minutes pour éviter l’effusion vectorielle. Ensuite, rétractez la canule et jetez-la dans un contenant pour objets tranchants présentant un risque biologique.
L’injection de vecteurs AAV portant le canal du transgène de la rhodopsine II dans le colliculus supérieur gauche, suivie d’une stimulation avec une lumière bleue continue à 40 milliwatts, a produit une série de potentiels d’action consécutifs. Les impulsions lumineuses d’une milliseconde n’ont pas réussi à évoquer des potentiels d’action à 40 milliwatts, mais les ont évoqués de manière fiable à 160 milliwatts. La stimulation optique du colliculus supérieur déclenchée par des saccades visuellement guidées a réduit progressivement le gain de saccade.
La lenteur de ce changement est compatible avec la plasticité induite par optogénétique. L’administration de lumière laser jaune au vermis oculomoteur après des injections d’AAV dans le nucleus reticularis tegmentae pontis a supprimé l’activité des fibres moussues, qui est une entrée dans le cervelet. Cette suppression a réduit l’activité cellulaire de Purkinje, qui est une sortie du cervelet.
Au cours de la suppression optogénétique, la vitesse de tir a diminué et s’est transformée en un motif de pores éclatés, suggérant que l’apport inhibé de fibres moussues aux cellules de Purkinje influence la phase de décélération de la saccade en entraînant le deuxième éclatement. La rhodopsine du canal a été exprimée exclusivement dans les cellules de Purkinje du vermis oculomoteur. L’émission de courtes impulsions lumineuses a augmenté l’activité de pointe simple d’une cellule de Purkinje isolée.
Une seule impulsion lumineuse de 1,5 milliseconde évoquait fréquemment plus d’un pic simple. L’activation optogénétique des pointes simples programmées pour se produire pendant la saccade a augmenté l’amplitude de la saccade, confirmant le rôle désinhibiteur des cellules de Purkinje sur le générateur de rafales oculomotrices. Les bulles d’air dans la canule peuvent perturber le ménisque vecteur d’huile, compliquer la détermination des volumes d’injection et empêcher un contrôle fin du débit.
Pour ces raisons, le chargement des solutions vectorielles sans bulles d’air est essentiel pour cette procédure. Six à huit semaines après l’injection, des manipulations optogénétiques peuvent être effectuées et le tissu cérébral peut être traité pour une analyse histologique. Cette technique permet aux chercheurs de tester de nombreux vecteurs chez quelques animaux, ce qui, à son tour, facilite le développement et la validation de nouveaux vecteurs.
Un domaine d’intérêt particulier actuel est le développement de vecteurs qui cibleront des types neuronaux spécifiques.
