מחקרים טיפוליים גנטיים ומדעי המוח רבים כוללים זריקות של וקטורים של AAV למוחות של פרימטים שאינם אנושיים. כדי שמחקרים אלה יצליחו, טכניקת ההזרקה חייבת להיות אמינה. טכניקת ההזרקה שלנו היא מיידית ומדויקת.
הליך זה עובד היטב להזרקה בבעלי חיים מורדמים או ערים. הצינורית הביתית שלנו קלה לטיפול ובעלות נמוכה. מי שידגים את ההליך יהיה קווין מאי, טכנאי הנדסה מהמעבדה שלי.
כדי להתחיל, קהה 30 מד 13 מ"מ מחט היפודרמית עם מטחנת דיסק. לאחר מכן, חתכו חתיכת צינורות נירוסטה לאורך בהתאם לעומק אזור מוח המטרה. בעזרת משחזת דיסקים, משופעים בקצה אחד של צינור החיתוך ומחליקים את השני.
מנטרלים את החלק הפנימי של הצינור עם סיכה. לאחר מכן, חתכו חתיכת צינורות PTFE לאורך המתאים לטעינת נפח הפתרון הווקטורי. התלקחות שני הקצוות של הצינור על ידי החדרת מחט היפודרמית קהה.
הכנס את המחט ההיפודרמית הקהה כחמישה מילימטרים לקצה אחד של צינור ה- PTFE. לאחר מכן הכנס את הקצה הלא משופע של צינורות הנירוסטה כחמישה מילימטרים לקצה השני. בדוק את הצינורית על ידי הזרקת מים מסוננים דרך רכזת המחט ההיפודרמית.
ודא שהמים יוצאים מקצה צינורות הנירוסטה המשופעים בצורה חלקה ושהמים אינם דולפים מאף אחד מהצמתים. לאחר בדיקת הצינורית, מניחים אותה בשקית אוטוקלאב ומעקרים אותה על ידי אוטוקלב. העבר בעדינות את הפתרון הווקטורי לצינור PCR מעוקר עם פיפטר P-20, תוך הימנעות מהיווצרות בועות.
לאחר מכן, חברו את הצינורית כשהקצה המשופע פונה כלפי מטה למחזיק סטריאוטקסי בעל אוריינטציה אנכית. לאחר מכן חברו מזרק מנעול לואר של מיליליטר אחד לרכזת המחט ההיפודרמית של הצינורית. השקע את הקצה המשופע בפתרון הווקטורי.
לאחר מכן, הפעל לחץ שלילי עדין עם מזרק של מיליליטר אחד כדי לטעון את התמיסה לתוך הצינורית תוך מעקב חזותי אחר המניסקוס בין התמיסה לאוויר. לאחר טעינת התמיסה הווקטורית, המשיכו בלחץ השלילי העדין עד שהתמיסה תגיע לרכזת המחט. לאחר מכן, הסר את המזרק של מיליליטר אחד והזריק באיטיות שמן מינרלי צבעוני לאורך הקיר הפנימי של רכזת המחט ההיפודרמית, תוך הקפדה להימנע מבועות אוויר.
חבר את רכזת המחט ההיפודרמית לאחת משתי היציאות הפתוחות של פקק נעילה תלת-כיווני. לאחר מכן, סגור את היציאה. מלאו מזרק של מיליליטר אחד באוויר וחברו אותו לאחת משתי היציאות האחרות.
לבסוף, סגור את היציאה הנותרת של stopcock כדי לחבר את המזרק לצינורית. הצמדת המזרק מכניסה את האוויר לתוך הפקק, והסטת האוויר ליציאה הפנויה מונעת ממנו לדחוף את התמיסה הווקטורית בחזרה במורד הצינורית. דחפו באיטיות את האוויר מהמזרק לתוך הצינורית.
ברגע שהשמן הצבעוני מופיע בקצה המחט הבוטה בצינורות ה-PTFE, בדקו אם יש אוויר בין התמיסה לשמן הצבעוני. המשיכו להפעיל לחץ חיובי עד שתיראה טיפה של תמיסה וקטורית בקצה הצינורית המשופעת. לאחר מכן, סגרו את הפקק כדי למנוע מהווקטור לצאת מהצינורית על ידי כוח הכבידה.
לאחר טעינת הפתרון הווקטורי, הצמידו את הצינורית למניפולטור הסטריאוטקסי. לאחר מכן, כדי לחבר את ה-stopcock למשאבת האוויר החשמלית, קח את צינור המשאבה מהעוזר הלא סטרילי. אחזו במחבר מנעול הלואר דרך דופן שרוול סטרילי.
שחררו את צווארון השרוול, ואפשרו לו להתרחב לאורך הצינור בכוח הכבידה. לאחר מכן, הצמידו את הפקק והדביקו את השרוול בחוזקה סביב מחבר מנעול הלואר. לאחר מכן, בדוק את משאבת האוויר ואת הצינורית על ידי הגדרת משאבת האוויר ללחץ נמוך, לפני הפעלתה והגברת הלחץ עד שהשמן מתקדם דרך הצינורית וטיפה של תמיסה וקטורית נראית בקצה הצינורית.
הדבק סרגל פלסטיק לצינורות PTFE כדי למדוד את תנועת המניסקוס במהלך ההזרקה. לאחר מכן, להניע את הצינורית למטה עם מניפולטור סטריאוטקסי עד קצה מגיע לפני השטח ולהקליט את העומק. סעו בצינורית לאתר העמוק ביותר שיש להזריק לאורך המסלול.
המשטח יתנפח במגע. כדי למזער את המיקוד השגוי עקב דחיסת רקמות, יש להוריד את הצינורית ולצלם את אתר ההזרקה העמוק ביותר ב-500 מיקרומטר. לאחר מכן, נסוגו באיטיות.
חלופות אחרות הן הנעת הצינורית באיטיות או נהיגה מהירה והמתנה בתחתית במשך דקה עד חמש דקות. לאחר מיקום הצינורית במקום ההזרקה העמוק ביותר, השתמש במשאבת האוויר החשמלית כדי להזריק 0.5 מיקרוליטר של התמיסה הווקטורית במשך 10 עד 30 שניות. אשר את זרימת ההזרקה על ידי מעקב אחר המניסקוס בין השמן הצבעוני לתמיסה הווקטורית בצינור PTFE.
לאחר המתנה של דקה, החזירו את הצינורית למקום ההזרקה הבא לאורך המסלול. לאחר ההזרקה הסופית, השאירו את הצינורית במקומה למשך 10 דקות כדי למנוע שטף וקטורי. לאחר מכן, החזירו את הצינורית והשליכו אותה למיכל של ביוהאזרד שארפ.
הזרקה של וקטורים AAV הנושאים את טרנסגן התעלה רודופסין II בקוליקולוס העליון השמאלי, ולאחר מכן גירוי עם אור כחול רציף ב 40 מילי-וואט, יצרה סדרה של פוטנציאלי פעולה עוקבים. פולסי אור של אלפית שנייה אחת לא הצליחו לעורר פוטנציאל פעולה ב-40 מילי-וואט, אך עוררו אותם באופן אמין ב-160 מילי-וואט. גירוי אופטי של הקוליקולוס העליון המופעל על ידי סקאדות מונחות חזותית הפחית את רווח הסקאדה בהדרגה.
האיטיות של שינוי זה עולה בקנה אחד עם פלסטיות הנגרמת על ידי אופטיקה. העברת אור לייזר צהוב לוורמיס האוקולומוטור לאחר זריקות AAV בגרעין הרשתית tegmentae pontis דיכאה את פעילות סיבי הטחב, שהיא קלט למוח הקטן. דיכוי זה הפחית את פעילות תאי Purkinje, שהיא פלט של המוח הקטן.
במהלך דיכוי אופטוגנטי, קצב הירי ירד והשתנה לדפוס נקבוביות מתפוצצות, מה שמרמז על כך שקלט סיבי הטחב המעוכבים לתאי Purkinje משפיע על שלב ההאטה של הסקאדה על ידי הנעת ההתפרצות השנייה. רודופסין ערוץ התבטא אך ורק בתאי Purkinje של vermis oculomotor. אספקה של פולסים קצרים של אור הגבירה את פעילות הספייק הפשוטה של תא Purkinje מבודד.
פולס אור יחיד של 1.5 אלפיות השנייה עורר לעתים קרובות יותר מזינוקים פשוטים אחד. הפעלת ספייק פשוטה אופטוגנטית מתוזמנת להתרחש במהלך הסקאדה הגדילה את משרעת הסקאדה, ואישרה את התפקיד הדיסאינהיביטורי של תאי Purkinje על מחולל ההתפרצות האוקולומוטורית. בועות אוויר בצינורית יכולות לשבש את מניסקוס וקטור השמן, לסבך את קביעת נפחי ההזרקה ולמנוע שליטה עדינה בקצב הזרימה.
מסיבות אלה, טעינת הפתרונות הווקטוריים ללא בועות אוויר היא קריטית להליך זה. שישה עד שמונה שבועות לאחר ההזרקה, מניפולציות אופטוגנטיות ניתן לבצע ואת רקמת המוח ניתן לעבד לניתוח היסטולוגי. טכניקה זו מאפשרת לחוקרים לבחון וקטורים רבים בבעלי חיים מעטים, אשר, בתורו, מקל על פיתוח ואימות של וקטורים חדשים.
תחום עניין מסוים כיום הוא בפיתוח וקטורים שיתמקדו בסוגים עצביים ספציפיים.
