Molti studi genetici terapeutici e neuroscientifici prevedono iniezioni di vettori AAV nel cervello di primati non umani. Affinché questi studi abbiano successo, la tecnica di iniezione deve essere affidabile. La nostra tecnica di iniezione è istantanea e precisa.
Questa procedura funziona bene per l'iniezione in animali anestetizzati o svegli. La nostra cannula fatta in casa è facile da maneggiare e a basso costo. A dimostrare la procedura sarà Kevin Mai, un tecnico di ingegneria del mio laboratorio.
Per iniziare, smussare una punta dell'ago ipodermica calibro 30 da 13 millimetri con una smerigliatrice a disco. Quindi, tagliare un pezzo di tubo di acciaio inossidabile a una lunghezza a seconda della profondità dell'area cerebrale target. Con una smerigliatrice a disco, smussare un'estremità del tubo tagliato e lisciare l'altra.
Sbavare l'interno del tubo con una spilla. Quindi, tagliare un pezzo di tubo in PTFE a una lunghezza appropriata per il volume della soluzione vettoriale da caricare. Flare entrambe le estremità del tubo inserendo l'ago ipodermico smussato.
Inserire l'ago ipodermico smussato di circa cinque millimetri in un'estremità del tubo di PTFE. Quindi inserire l'estremità non smussata del tubo in acciaio inossidabile di circa cinque millimetri nell'altra estremità. Testare la cannula iniettando acqua filtrata attraverso il mozzo dell'ago ipodermico.
Verificare che l'acqua esca uniformemente dalla punta del tubo in acciaio inossidabile smussato e che l'acqua non fuoriesca da nessuna delle giunzioni. Dopo aver testato la cannula, metterla in un sacchetto per autoclave e sterilizzarla in autoclave. Trasferire delicatamente la soluzione vettoriale in un tubo PCR sterilizzato con un pipetter P-20, evitando la formazione di bolle.
Quindi, attaccare la cannula con la punta smussata rivolta verso il basso a un supporto stereotassico orientato verticalmente. Quindi collegare una siringa luer lock da un millilitro al mozzo dell'ago ipodermico della cannula. Immergere la punta smussata nella soluzione vettoriale.
Quindi, applicare una leggera pressione negativa con la siringa da un millilitro per caricare la soluzione nella cannula mentre si segue visivamente il menisco tra la soluzione e l'aria. Una volta caricata la soluzione vettoriale, continuare la leggera pressione negativa fino a quando la soluzione raggiunge il mozzo dell'ago. Quindi, rimuovere la siringa da un millilitro e iniettare lentamente olio minerale colorato lungo la parete interna del mozzo dell'ago ipodermico, avendo cura di evitare bolle d'aria.
Collegare il mozzo dell'ago ipodermico a una delle due porte aperte di un rubinetto di arresto luer a tre vie. Quindi, chiudere la porta. Riempire una siringa da un millilitro con aria e collegarla a una delle altre due porte.
Infine, chiudere la porta rimanente del rubinetto di arresto per collegare la siringa alla cannula. Il collegamento della siringa forza l'aria nel rubinetto di arresto e lo spostamento di quest'aria verso la porta non occupata impedisce di spingere la soluzione vettoriale lungo la cannula. Spingere lentamente l'aria dalla siringa nella cannula.
Una volta che l'olio colorato appare sulla punta dell'ago smussato nel tubo in PTFE, controllare l'aria tra la soluzione e l'olio colorato. Continuare ad applicare una pressione positiva fino a quando una goccia di soluzione vettoriale è visibile sulla punta della cannula smussata. Quindi, chiudere il rubinetto di arresto per evitare che il vettore esca dalla cannula per gravità.
Una volta caricata la soluzione vettoriale, fissare la cannula al manipolatore stereotassico. Quindi, per collegare il rubinetto alla pompa dell'aria elettrica, prendere il tubo della pompa dall'assistente non sterile. Afferrare il connettore luer lock attraverso la parete di un manicotto sterile.
Rilasciare il colletto della manica, permettendogli di estendersi lungo il tubo per gravità. Quindi, fissare il rubinetto e fissare saldamente il manicotto attorno al connettore luer lock. Quindi, testare la pompa dell'aria e la cannula impostando la pompa dell'aria a bassa pressione, prima di accenderla e aumentare la pressione fino a quando l'olio avanza attraverso la cannula e una goccia di soluzione vettoriale è visibile sulla punta della cannula.
Fissare un righello di plastica al tubo in PTFE per misurare il movimento del menisco durante l'iniezione. Quindi, guidare la cannula verso il basso con il manipolatore stereotassico fino a quando la punta raggiunge la superficie e registrare la profondità. Guidare la cannula nel punto più profondo da iniettare lungo la pista.
La superficie si increspa al contatto. Per ridurre al minimo l'errore di targeting dovuto alla compressione tissutale, spingere la cannula verso il basso e superare il sito di iniezione più profondo di 500 micrometri. Quindi, ritrarre lentamente.
Altre alternative sono guidare la cannula lentamente verso il basso o guidarla rapidamente e aspettare sul fondo da uno a cinque minuti. Una volta posizionata la cannula nel sito di iniezione più profondo, utilizzare la pompa dell'aria elettrica per iniettare 0,5 microlitri della soluzione vettoriale in 10-30 secondi. Confermare il flusso di iniezione tracciando il menisco tra l'olio colorato e la soluzione vettoriale nel tubo di PTFE.
Dopo aver atteso un minuto, ritrarre la cannula nel sito di iniezione successivo lungo il binario. Dopo l'iniezione finale, lasciare la cannula in posizione per 10 minuti per evitare efflussi vettoriali. Quindi, ritrarre la cannula e gettarla in un contenitore per taglienti a rischio biologico.
L'iniezione di vettori AAV che trasportano il transgene canale della rodopsina II nel collicolo superiore sinistro, seguita da stimolazione con luce blu continua a 40 milliwatt, ha prodotto una serie di potenziali d'azione consecutivi. Gli impulsi di luce di un millisecondo non sono riusciti a evocare potenziali d'azione a 40 milliwatt, ma li hanno evocati in modo affidabile a 160 milliwatt. La stimolazione ottica del collicolo superiore innescata da saccadi guidate visivamente ha ridotto gradualmente il guadagno di saccade.
La lentezza di questo cambiamento è coerente con la plasticità indotta optogeneticamente. La consegna di luce laser gialla al verme oculomotore dopo iniezioni di AAV nel nucleo reticularis tegmentae pontis ha soppresso l'attività delle fibre muschiose, che è un input per il cervelletto. Questa soppressione ha ridotto l'attività delle cellule di Purkinje, che è un output del cervelletto.
Durante la soppressione optogenetica, la velocità di accensione è diminuita e cambiata in un modello di pori di scoppio, suggerendo che l'input inibito di fibre muschiose alle cellule di Purkinje influenza la fase di decelerazione della saccade guidando la seconda raffica. La rodopsina canale era espressa esclusivamente nelle cellule di Purkinje del verme oculomotore. La somministrazione di brevi impulsi luminosi ha aumentato la semplice attività di picco di una cellula di Purkinje isolata.
Un singolo impulso luminoso di 1,5 millisecondi evocava frequentemente più di un semplice picco. L'attivazione del picco semplice optogenetico temporizzata per verificarsi durante la saccade ha aumentato l'ampiezza della saccade, confermando il ruolo disinibitorio delle cellule di Purkinje sul generatore di burst oculomotorio. Le bolle d'aria nella cannula possono interrompere il menisco del vettore dell'olio, complicare la determinazione dei volumi di iniezione e impedire un controllo fine della portata.
Per questi motivi, il caricamento delle soluzioni vettoriali senza bolle d'aria è fondamentale per questa procedura. Da sei a otto settimane dopo l'iniezione, possono essere eseguite manipolazioni optogenetiche e il tessuto cerebrale può essere elaborato per l'analisi istologica. Questa tecnica consente ai ricercatori di testare molti vettori in pochi animali, il che, a sua volta, facilita lo sviluppo e la convalida di nuovi vettori.
Una particolare area di interesse attuale è lo sviluppo di vettori che colpiranno specifici tipi neuronali.
