Muitos estudos terapêuticos genéticos e neurocientíficos envolvem as injeções de vetores AAV nos cérebros de primatas não humanos. Para que esses estudos sejam bem sucedidos, a técnica de injeção deve ser confiável. Nossa técnica de injeção é instantânea e precisa.
Este procedimento funciona bem para injeção em animais anestesiados ou acordados. Nossa cânula caseira é fácil de manusear e de baixo custo. Demonstrando o procedimento estará Kevin Mai, um técnico de engenharia do meu laboratório.
Para começar, corte uma ponta de agulha hipodérmica de calibre 30 milímetros com um moedor de disco. Em seguida, corte um pedaço de tubo de aço inoxidável a um comprimento dependendo da profundidade da área cerebral alvo. Com um moedor de disco, desenhe uma extremidade do tubo de corte e suavize a outra.
Desburr o interior do tubo com um broche. Em seguida, corte um pedaço de tubo PTFE a um comprimento apropriado para que o volume da solução vetorial seja carregado. Flare ambas as extremidades do tubo inserindo a agulha hipodérmica sem cortes.
Insira a agulha hipodérmica em linha, aproximadamente cinco milímetros, em uma extremidade do tubo PTFE. Em seguida, insira a extremidade nãovelada da tubulação de aço inoxidável aproximadamente cinco milímetros na outra extremidade. Teste a cânula injetando água filtrada através do cubo de agulha hipodérmica.
Confirme se a água sai da ponta de tubo de aço inoxidável chanfrado sem problemas e que a água não vaze de nenhuma das junções. Depois de testar a cânula, coloque-a em um saco de autoclave e esterilize-a autoclaving. Transfira suavemente a solução vetorial para um tubo PCR esterilizado com uma tubulação P-20, evitando a formação de bolhas.
Em seguida, conecte a cânula com a ponta chanfrada voltada para baixo para um suporte estereutílico orientado verticalmente. Em seguida, conecte uma seringa de bloqueio de um mililitro ao centro de agulha hipodérmica da cânula. Submergir a ponta chanfrada na solução vetorial.
Em seguida, aplique uma pressão negativa suave com a seringa de um mililitro para carregar a solução na cânula enquanto rastreia visualmente o menisco entre a solução e o ar. Uma vez que a solução vetorial tenha sido carregada, continue a pressão negativa suave até que a solução chegue ao cubo da agulha. Em seguida, remova a seringa de um mililitro e injete lentamente óleo mineral colorido ao longo da parede interna do cubo de agulha hipodérmica, tomando o cuidado de evitar bolhas de ar.
Conecte o cubo de agulha hipodérmica a uma das duas portas abertas de uma torneira de bloqueio de três vias. Então, feche o porto. Encha uma seringa de um mililitro com ar e anexe-a a qualquer uma das outras duas portas.
Finalmente, feche a porta restante da torneira para conectar a seringa à cânula. Anexar a seringa força o ar na torneira, e desviar este ar para o porto desocupado impede que ele empurre a solução vetorial de volta para baixo da cânula. Empurre lentamente o ar da seringa para a cânula.
Uma vez que o óleo colorido apareça na ponta da agulha cega na tubulação PTFE, verifique se há ar entre a solução e o óleo colorido. Continue aplicando pressão positiva até que uma gota de solução vetorial seja visível na ponta da cânula chanfrada. Em seguida, feche a torneira para evitar que o vetor saia da cânula pela gravidade.
Uma vez carregada a solução vetorial, afixe a cânula no manipulador estereotítico. Em seguida, para conectar a torneira à bomba de ar elétrica, pegue o tubo de bomba do assistente não estéril. Segure o conector de trava de luer através da parede de uma manga estéril.
Solte a gola da manga, permitindo que ela se estenda ao longo do tubo pela gravidade. Em seguida, afixe a torneira e tape a manga firmemente ao redor do conector de trava de luer. Em seguida, teste a bomba de ar e a cânula, colocando a bomba de ar em baixa pressão, antes de ligá-la e aumentar a pressão até que o óleo avance pela cânula e uma gota de solução vetorial seja visível na ponta da cânula.
Tape uma régua de plástico na tubulação PTFE para medir o movimento do menisco durante a injeção. Em seguida, dirija a cânula para baixo com o manipulador estereotaxico até que a ponta atinja a superfície e grave a profundidade. Dirija a cânula até o local mais profundo a ser injetado ao longo da pista.
A superfície vai coçar após o contato. Para minimizar o direcionamento errado devido à compressão tecidual, acione a cânula para baixo e supere o local de injeção mais profundo em 500 micrômetros. Então, retraia lentamente.
Outras alternativas são conduzir a cânula para baixo lentamente ou dirigi-la rapidamente e esperar na parte inferior por um a cinco minutos. Uma vez que a cânula esteja posicionada no local de injeção mais profundo, use a bomba de ar elétrica para injetar 0,5 microliters da solução vetorial durante 10 a 30 segundos. Confirme o fluxo de injeção rastreando o menisco entre o óleo colorido e a solução vetorial no tubo PTFE.
Depois de esperar por um minuto, retraia a cânula para o próximo local de injeção ao longo da pista. Após a injeção final, deixe a cânula no lugar por 10 minutos para evitar efflux vetorial. Em seguida, retraia a cânula e descarte-a em um recipiente de agudos de risco biológico.
A injeção de vetores AAV carregando o canal rhodopsin II transgene no colliculus superior esquerdo, seguido de estimulação com luz azul contínua a 40 miliwatts, produziu uma série de potenciais de ação consecutivos. Pulsos de luz de um milissegundo não conseguiram evocar potenciais de ação a 40 miliwatts, mas os evocaram de forma confiável a 160 miliwatts. Estimulação óptica do colículo superior desencadeada por saccades visualmente guiadas reduziu gradualmente o ganho de saccade.
A lentidão desta mudança é consistente com a plasticidade optogeneticamente induzida. Entrega de luz laser amarela à vermícula oculomotor após injeções de AAV no núcleo reticularis tegmentae pontis suprimida atividade de fibra de musgo, que é uma entrada para o cerebelo. Esta supressão reduziu a atividade da célula Purkinje, que é uma saída do cerebelo.
Durante a supressão optogenética, a taxa de disparo diminuiu e mudou para um padrão de poros estourado, sugerindo que a entrada inibida de fibra de musgo para células Purkinje influencia a fase de desaceleração saccade, conduzindo a segunda explosão. A rodopsina do canal foi expressa exclusivamente em células Purkinje dos vermis oculomotores. A entrega de pulsos de luz curta aumentou a atividade de pico simples de uma célula Purkinje isolada.
Um único pulso de luz de 1,5 milissegundos frequentemente evocava mais de um simples pico. Ativação de pico simples optogenético cronometrada para ocorrer durante a saccade aumentou a amplitude do saccade, confirmando o papel de desinhibitório das células Purkinje no gerador de explosão oculomotor. Bolhas de ar na cânula podem interromper o menisco vetorial do vetor de óleo, complicar a determinação dos volumes de injeção e evitar um bom controle da vazão.
Por essas razões, carregar as soluções vetoriais sem bolhas de ar é fundamental para este procedimento. Seis a oito semanas após a injeção, manipulações optogenéticas podem ser realizadas e o tecido cerebral pode ser processado para análise histológica. Essa técnica permite aos pesquisadores testar muitos vetores em poucos animais, o que, por sua vez, facilita o desenvolvimento e validação de novos vetores.
Uma área específica de interesse atual é o desenvolvimento de vetores que atingirão tipos neuronais específicos.
