Birçok gen terapötik ve nörobilimsel çalışma, AAV vektörlerinin insan olmayan primatların beyinlerine enjekte edilmesini içerir. Bu çalışmaların başarılı olabilmesi için enjeksiyon tekniğinin güvenilir olması gerekmektedir. Enjeksiyon tekniğimiz anlık ve doğrudur.
Bu prosedür anestezi uygulanmış veya uyanık hayvanlarda enjeksiyon için iyi çalışır. Ev yapımı kanülümüzün kullanımı kolaydır ve düşük maliyetlidir. Prosedürü gösteren, laboratuvarımdan bir mühendislik teknisyeni olan Kevin Mai olacak.
Başlamak için, 30 gauge 13 milimetrelik hipodermik iğne ucunu bir disk öğütücü ile köreltin. Ardından, hedef beyin bölgesinin derinliğine bağlı olarak bir parça paslanmaz çelik boru parçasını uzunluğa kadar kesin. Bir disk taşlama makinesi ile, kesme borusunun bir ucunu eğimlendirin ve diğerini pürüzsüzleştirin.
Tüpün içini bir broş ile çapak alın. Daha sonra, bir parça PTFE borusunu, yüklenecek vektör çözeltisi hacmine uygun bir uzunluğa kadar kesin. Körelmiş hipodermik iğneyi sokarak tüpün her iki ucunu da parlatın.
Körelmiş hipodermik iğneyi PTFE tüpünün bir ucuna yaklaşık beş milimetre yerleştirin. Ardından, paslanmaz çelik borunun eğimsiz ucunu yaklaşık beş milimetre diğer uca yerleştirin. Hipodermik iğne göbeğinden filtrelenmiş su enjekte ederek kanülü test edin.
Suyun eğimli paslanmaz çelik boru ucundan sorunsuz bir şekilde çıktığını ve suyun her iki bağlantıdan da sızmadığını doğrulayın. Kanülü test ettikten sonra, bir otoklav torbasına koyun ve otoklavlama ile sterilize edin. Vektör çözeltisini bir P-20 pipetleyici ile sterilize edilmiş bir PCR tüpüne nazikçe aktarın ve kabarcık oluşumunu önleyin.
Ardından, kanülü eğimli ucu aşağıya bakacak şekilde dikey olarak yönlendirilmiş bir stereotaksik tutucuya takın. Ardından, kanülün hipodermik iğne göbeğine bir mililitrelik luer kilit şırıngası bağlayın. Eğimli ucu vektör çözeltisine batırın.
Daha sonra, çözelti ve hava arasındaki menisküsü görsel olarak izlerken, çözeltiyi kanüle yüklemek için bir mililitrelik şırınga ile hafif negatif basınç uygulayın. Vektör çözeltisi yüklendikten sonra, çözelti iğne göbeğine ulaşana kadar nazik negatif basınca devam edin. Daha sonra, bir mililitrelik şırıngayı çıkarın ve hava kabarcıklarını önlemeye özen göstererek hipodermik iğne göbeğinin iç duvarı boyunca renkli mineral yağı yavaşça enjekte edin.
Hipodermik iğne göbeğini, üç yönlü luer kilit durdurucusunun iki açık bağlantı noktasından birine takın. Ardından, bağlantı noktasını kapatın. Bir mililitrelik bir şırıngayı hava ile doldurun ve diğer iki bağlantı noktasından birine takın.
Son olarak, şırıngayı kanüle bağlamak için stopcock'un kalan portunu kapatın. Şırınganın takılması, havayı stopcock'a zorlar ve bu havayı boş limana yönlendirmek, vektör çözeltisini kanülden aşağı itmesini önler. Havayı yavaşça şırıngadan kanüle doğru itin.
Renkli yağ, PTFE borusundaki künt iğnenin ucunda göründüğünde, çözelti ile renkli yağ arasındaki havayı kontrol edin. Eğimli kanül ucunda bir damla vektör çözeltisi görünene kadar pozitif basınç uygulamaya devam edin. Ardından, vektörün kanülden yerçekimi ile çıkmasını önlemek için stopcock'u kapatın.
Vektör çözeltisi yüklendikten sonra, kanülü stereotaksik manipülatöre yapıştırın. Ardından, durdurmayı elektrikli hava pompasına bağlamak için, pompa borusunu steril olmayan asistandan alın. Luer kilit konektörünü steril bir manşonun duvarından tutun.
Manşonun yakasını bırakın, tüp boyunca yerçekimi ile uzanmasına izin verin. Ardından, durdurma musluğunu takın ve manşonu luer kilit konektörünün etrafına sıkıca bantlayın. Daha sonra, hava pompasını ve kanülü, açmadan ve yağ kanülden ilerleyene ve kanül ucunda bir damla vektör çözeltisi görünene kadar basıncı arttırmadan önce düşük basınca ayarlayarak hava pompasını ve kanülü test edin.
Enjeksiyon sırasında menisküsün hareketini ölçmek için plastik bir cetveli PTFE borusuna bantlayın. Ardından, kanülü stereotaksik manipülatörle uç yüzeye ulaşana kadar aşağı doğru sürün ve derinliği kaydedin. Kanülü pist boyunca enjekte edilecek en derin bölgeye sürün.
Yüzey temas ettiğinde çukurlaşacaktır. Doku sıkışması nedeniyle yanlış hedeflemeyi en aza indirmek için, kanülü aşağı doğru sürün ve en derin enjeksiyon bölgesini 500 mikrometre aşın. Ardından, yavaşça geri çekin.
Diğer alternatifler kanülü yavaşça aşağı sürmek veya hızlı bir şekilde sürmek ve altta bir ila beş dakika beklemektir. Kanül en derin enjeksiyon bölgesine yerleştirildikten sonra, vektör çözeltisinin 0,5 mikrolitresini 10 ila 30 saniye boyunca enjekte etmek için elektrikli hava pompasını kullanın. Renkli yağ ile PTFE tüpündeki vektör çözeltisi arasındaki menisküsü izleyerek enjeksiyon akışını onaylayın.
Bir dakika bekledikten sonra, kanülü iz boyunca bir sonraki enjeksiyon bölgesine geri çekin. Son enjeksiyondan sonra, vektör efflux'ü önlemek için kanülü 10 dakika yerinde bırakın. Ardından, kanülü geri çekin ve biyolojik tehlike keskinliği kabına atın.
Sol üst kollikulusta rodopsin II transgeni kanalını taşıyan AAV vektörlerinin enjeksiyonu, ardından 40 miliwatt'ta sürekli mavi ışıkla stimülasyon, bir dizi ardışık aksiyon potansiyeli üretti. Bir milisaniyelik ışık darbeleri, 40 miliwatt'ta aksiyon potansiyellerini uyandıramadı, ancak onları 160 miliwatt'ta güvenilir bir şekilde uyandırdı. Görsel olarak yönlendirilen sakkadların tetiklediği superior kollikulusun optik stimülasyonu, sakkad kazancını kademeli olarak azaltmıştır.
Bu değişimin yavaşlığı, optogenetik olarak indüklenen plastisite ile tutarlıdır. Nükleus reticularis tegmentae pontis'teki AAV enjeksiyonlarından sonra okülomotor vermise sarı lazer ışığının verilmesi, beyinciğin bir girdisi olan yosunlu lif aktivitesini baskıladı. Bu baskılama, beyinciğin bir çıktısı olan Purkinje hücre aktivitesini azalttı.
Optogenetik baskılama sırasında, ateşleme hızı azaldı ve bir patlama gözenekleri modeline dönüştü, bu da Purkinje hücrelerine inhibe edilmiş yosunlu lif girişinin ikinci patlamayı sürerek sakkad yavaşlama fazını etkilediğini düşündürmektedir. Kanal rodopsin, sadece okülomotor vermisin Purkinje hücrelerinde eksprese edildi. Kısa ışık darbelerinin verilmesi, izole edilmiş bir Purkinje hücresinin basit başak aktivitesini arttırdı.
Tek bir 1,5 milisaniyelik ışık darbesi sıklıkla birden fazla basit ani artışı uyandırdı. Optogenetik basit başak aktivasyonu, sakkad genliğini artırarak Purkinje hücrelerinin okülomotor patlama jeneratörü üzerindeki inhibitör rolünü doğrulayarak, sakkad genliğini arttırdı. Kanüldeki hava kabarcıkları, yağ vektörü menisküsünü bozabilir, enjeksiyon hacimlerinin belirlenmesini zorlaştırabilir ve akış hızının hassas kontrolünü önleyebilir.
Bu nedenlerden dolayı, vektör çözeltilerinin hava kabarcıkları olmadan yüklenmesi bu prosedür için kritik öneme sahiptir. Enjeksiyondan altı ila sekiz hafta sonra, optogenetik manipülasyonlar yapılabilir ve beyin dokusu histolojik analiz için işlenebilir. Bu teknik, araştırmacıların birkaç hayvanda birçok vektörü test etmelerini sağlar ve bu da yeni vektörlerin geliştirilmesini ve doğrulanmasını kolaylaştırır.
Mevcut ilgi alanının belirli bir alanı, belirli nöronal tipleri hedef alacak vektörlerin geliştirilmesidir.
