Перечисление колониеобразующих единиц ограничивало воспроизводимость исследований в области ИМП. Биолюминесцентная визуализация будет продвигать исследования имп in vivo по физиологии мочевого пузыря, патогенезу ИМП и восприимчивости. Биолюминесцентная визуализация позволяет проводить продольное наблюдение с пониманием эволюции инфекции в режиме реального времени.
Более того, это резко сокращает количество необходимых животных. Биолюминесцентная визуализация облегчает исследования рецидивирующих или хронических инфекций, которые часто встречаются у людей. Кроме того, исследователи могут идентифицировать восходящие инфекции или распространение в кровь с помощью биолюминесцентной визуализации.
Получение одиночных колоний путем удаления глицеринового запаса бактерий с помощью прививочной петли на пластинах LB, дополненных сульфатом канамицина, и культивирования в течение ночи при 37 градусах Цельсия. Наполните стерильную 14-миллилитровую полистирольную трубку с круглым дном, с двухпозиционными защелками с пятью миллилитрами бульона LB, дополненного сульфатом канамицина. Выберите одну бактериальную колонию с петлей прививки и добавьте ее в бульон LB.
Вихрь в течение 10 секунд для обеспечения правильного перемешивания. Культивируйте статически с защелкивающейся крышкой в открытом положении при 37 градусах Цельсия в течение ночи. После инкубации вихрьте трубку в течение 10 секунд, чтобы обеспечить надлежащую гомогенизацию бактериальной культуры.
Создайте субкультуру в Эрленмейере, добавив 25 микролитров бактериальной суспензии к 25 миллилитрам свежей среды LB без антибиотиков. Закройте Эрленмейер и культуру статически на ночь. В день установки перелейте культуру из Эрленнмейера в 50-миллилитровую культуральную трубку и центрифугу.
Декантировать супернатант и повторно суспендировать бактериальную гранулу в 10 миллилитрах стерильного PBS. Снова вращайте трубку в течение 10 секунд. Выберите экспериментальную концентрацию инокулята и определите соответствующий ОД при 600 нанометрах с помощью стандартной кривой.
Добавляют один миллилитр повторно суспендированной бактериальной культуры в девять миллилитров стерильного PBS и регулируют до тех пор, пока не будет достигнут желаемый OD 600 нанометров. Установите стерильный наконечник ангиокатетера 24-го калибра на 100-микролитровый шприц. Наполните шприц приготовленным бактериальным раствором.
Поместите одно животное на рабочую поверхность в положении лежа на спине и поддерживайте стабильную изофлурановую анестезию с помощью носового конуса во время установки. Нанесите глазную мазь. Изгоняют остаточную мочу, применяя мягкое сжатие и совершая круговые движения по надлобковой области, затем очищают нижнюю часть живота 70% этанолом.
Смажьте кончик катетера обычным физиологическим раствором. Положите указательный палец на недоминирующую руку на животе и осторожно протолкните его вверх. Начинают катетеризацию уретры вертикально под углом 90 градусов.
Как только сопротивление встретится, наклоните его горизонтально, прежде чем вставлять его дальше. Выполните медленную установку 50 микролитров бактериального инокулята. После установки держите шприц и катетер на месте еще несколько секунд, а затем медленно втягивайте, чтобы предотвратить утечку.
Используйте один катетер на экспериментальную группу. Поместите животное в положение лежа на спине в носовом конусе, чтобы подготовить его к визуализации, и подготовьте его к визуализации с использованием одного катетера на экспериментальную группу. При необходимости назначают антибиотики или экспериментальные препараты, как указано в тексте рукописи.
Откройте программное обеспечение для сбора BLI и нажмите «Инициализировать» в устройстве обработки изображений, чтобы протестировать систему контроллера камеры и сцены и охладить камеру устройства с зарядовой связью до минус 90 градусов по Цельсию. Нажмите «Получение», «Автосохранение».Выберите люминесценцию и фотографию. Проверьте настройки люминесцентности по умолчанию, установив для фильтра возбуждения значение Блокировать, а для фильтра излучения — значение Открыть.
Установите время экспозиции на автоматическое при съемке первого изображения. Для измерений in vivo и ярких сигналов установите время экспозиции около 30 секунд. Сократите время экспозиции, если появляется предупреждение из-за насыщенного изображения.
Выберите среднее биннинг, F/stop one и выберите правильный FOV. Установите высоту объекта в один сантиметр при визуализации мышей. Визуализируйте до пяти миль одновременно и разделяйте животных, используя световую перегородку, чтобы предотвратить отражение.
Закройте дверь и нажмите «Получить», чтобы начать последовательность изображений, затем заполните подробную информацию об эксперименте. Извлеките мышей из камеры визуализации и верните их в клетку. Проверьте полное восстановление после анестезии, затем верните клетки в вентилируемые стойки до следующего цикла визуализации.
Запустите программное обеспечение для создания образов и загрузите экспериментальный файл, нажав кнопку Обзор. Используйте инструментальную палитру для настройки цветовой шкалы изображения. Используйте инструменты ROI, чтобы нарисовать интересующую область на изображении, гарантируя, что она достаточно велика, чтобы покрыть всю область, и используя одинаковые размеры для всех изображений.
Затем нажмите на измерение ROI, чтобы количественно оценить интенсивность света. Последующие изображения мышей, полученные сразу после установки, показали, что их надежно обнаруживается выше 20 000 колониеобразующих единиц, и была установлена линейная корреляция между колониеобразующими единицами инокулята и биолюминесценцией in vivo. Естественная эволюция инфекции мочевыводящих путей была изучена в контрольной группе, которая не получала никакого лечения.
Влияние лечения антибиотиками на кинетику инфекции было детально визуализировано в группе животных, получавших антибиотики. Немедленное снижение бактериальной нагрузки, измеренное общим потоком фотонов, наблюдалось после первой дозы энрофлоксацина. Ни у одного из обработанных животных не было последующего повышения бактериальной нагрузки.
Общая бактериальная нагрузка каждого животного была рассчитана с использованием площади под кривой логарифмического преобразованного общего потока фотонов, показав значительную разницу между животными, получавшими энрофлоксацин, и необработанными животными в течение 10 дней. Эти результаты являются доказательством того, что BLI может быть использован для оценки различий в кинетике инфекции ИМП. Биолюминесцентная визуализация является неинвазивным методом, который можно комбинировать с другими методами, такими как регулярный сбор образцов мочи для бактериального или биохимического анализа или для экспериментов.
Здесь мы продемонстрировали, что биолюминесцентная визуализация является мощным инструментом для оценки новых терапевтических стратегий течения заболевания инфекций мочевыводящих путей.
