Die Aufzählung der koloniebildenden Einheiten schränkte die Reproduzierbarkeit der Forschung im Bereich der Harnwegsinfektion ein. Die Biolumineszenz-Bildgebung wird die In-vivo-UTI-Forschung zur Blasenphysiologie, Harnwegsinfektionspathogenese und Suszeptibilität vorantreiben. Die Biolumineszenz-Bildgebung ermöglicht eine longitudinale Nachsorge mit Echtzeit-Einblick in die Entwicklung der Infektion.
Darüber hinaus reduziert es drastisch die Anzahl der benötigten Tiere. Die Biolumineszenz-Bildgebung erleichtert die Erforschung wiederkehrender oder chronischer Infektionen, die beim Menschen häufig auftreten. Darüber hinaus können Forscher aufsteigende Infektionen oder die Verbreitung im Blut mithilfe der Biolumineszenzbildgebung identifizieren.
Erhalten Sie einzelne Kolonien, indem Sie den Glycerinbestand von Bakterien mit einer Impfschleife auf LB-Platten, die mit Kanamycinsulfat ergänzt werden, ausstreifen und über Nacht bei 37 Grad Celsius kultivieren. Füllen Sie ein steriles rundes 14-Milliliter-Polystyrol-Bodenrohr mit zweistufigen Schnappkappen mit fünf Millilitern LB-Brühe, ergänzt mit Kanamycinsulfat. Wählen Sie eine einzelne Bakterienkolonie mit einer Impfschleife und fügen Sie diese der LB-Brühe hinzu.
Wirbel für 10 Sekunden, um eine ordnungsgemäße Mischung zu gewährleisten. Kultur statisch mit dem Schnappverschluss in geöffneter Position bei 37 Grad Celsius über Nacht. Nach der Inkubation das Röhrchen 10 Sekunden lang verwirbeln, um eine ordnungsgemäße Homogenisierung der Bakterienkultur zu gewährleisten.
Machen Sie eine Subkultur im Erlenmeyer, indem Sie 25 Mikroliter der Bakteriensuspension zu 25 Millilitern frischem LB-Medium ohne Antibiotika hinzufügen. Schließen Sie den Erlenmeyer und die Kultur über Nacht statisch. Am Tag der Installation gießen Sie die Kultur aus dem Erlennmeyer in ein 50-Milliliter-Kulturrohr und zentrifugieren.
Dekantieren Sie den Überstand und resuspenieren Sie das Bakterienpellet in 10 Milliliter sterilem PBS. Wirbeln Sie die Röhre erneut für 10 Sekunden. Wählen Sie die experimentelle Konzentration des Inokulums und bestimmen Sie die entsprechende OD bei 600 Nanometern unter Verwendung der Standardkurve.
Einen Milliliter der resuspendierten Bakterienkultur in neun Milliliter steriles PBS geben und justieren, bis die gewünschten OD 600 Nanometer erreicht sind. Montieren Sie eine sterile 24-Gauge-Angiokatheterspitze auf einer 100-Mikroliter-Spritze. Füllen Sie die Spritze mit der vorbereiteten Bakterienlösung.
Legen Sie ein Tier auf eine Arbeitsfläche in Rückenlage und halten Sie während der Installation eine stabile Isofluran-Anästhesie mit einem Nasenkonus aufrecht. Tragen Sie die Augensalbe auf. Vertreiben Sie den Resturin durch sanfte Kompression und kreisförmige Bewegungen auf der suprapubischen Region, reinigen Sie dann den Unterbauch mit 70% Ethanol.
Schmieren Sie die Katheterspitze mit normaler Kochsalzlösung. Legen Sie den Zeigefinger auf die nicht dominante Hand auf den Bauch und drücken Sie ihn sanft nach oben. Beginnen Sie die Katheterisierung der Harnröhre vertikal in einem 90-Grad-Winkel.
Sobald ein Widerstand auftritt, neigen Sie ihn horizontal, bevor Sie ihn weiter einsetzen. Führen Sie eine langsame Installation von 50 Mikrolitern des bakteriellen Inokulums durch. Halten Sie nach der Installation die Spritze und den Katheter noch einige Sekunden an Ort und Stelle und ziehen Sie sie dann langsam zurück, um ein Auslaufen zu vermeiden.
Verwenden Sie einen Katheter pro Versuchsgruppe. Positionieren Sie das Tier in Rückenlage im Nasenkegel, um es für die Bildgebung vorzubereiten, und bereiten Sie es mit einem Katheter pro Versuchsgruppe für die Bildgebung vor. Falls erforderlich, verabreichen Sie Antibiotika oder experimentelle Medikamente, wie im Textmanuskript erwähnt.
Öffnen Sie die BLI-Erfassungssoftware und klicken Sie im Bildgerät auf Initialisieren, um das Kamera- und Stage-Controller-System zu testen und die ladungsgekoppelte Gerätekamera auf minus 90 Grad Celsius abzukühlen. Klicken Sie auf Aufnahme, AutoSpeichern an.Wählen Sie Lumineszenz und Foto. Überprüfen Sie die Standard-Lumineszenzeinstellungen, indem Sie den Anregungsfilter auf Block und den Emissionsfilter auf Offen einstellen.
Stellen Sie die Belichtungszeit bei der Aufnahme des ersten Bildes auf auto. Für In-vivo-Messungen und helle Signale stellen Sie die Belichtungszeit auf etwa 30 Sekunden ein. Reduzieren Sie die Belichtungszeit, wenn aufgrund eines gesättigten Bildes eine Warnung angezeigt wird.
Wählen Sie das Medium Binning, F / Stop one, und wählen Sie das richtige FOV. Stellen Sie die Motivhöhe bei der Bildgebung von Mäusen auf einen Zentimeter ein. Stellen Sie sich bis zu fünf Meilen gleichzeitig vor und trennen Sie die Tiere mithilfe der Lichtleitwand, um Reflexionen zu verhindern.
Schließen Sie die Tür und klicken Sie auf Erfassen, um die Bildgebungssequenz zu starten, und geben Sie dann detaillierte Informationen über das Experiment ein. Entfernen Sie Mäuse aus der Bildgebungskammer und bringen Sie sie in ihren Käfig zurück. Überprüfen Sie die vollständige Genesung nach der Anästhesie und bringen Sie die Käfige bis zum nächsten Bildgebungszyklus in die belüfteten Racks zurück.
Starten Sie die Imaging-Software und laden Sie die experimentelle Datei, indem Sie auf Durchsuchen klicken. Verwenden Sie die Werkzeugpalette, um die Farbskala des Bildes anzupassen. Verwenden Sie die ROI-Tools, um eine Region von Interesse auf das Bild zu zeichnen, um sicherzustellen, dass es groß genug ist, um den gesamten Bereich abzudecken und die gleichen Abmessungen für alle Bilder zu verwenden.
Klicken Sie dann auf ROI-Messung, um die Lichtintensität zu quantifizieren. Nachfolgende Bilder von Mäusen, die unmittelbar nach der Installation aufgenommen wurden, zeigten, dass sie über 20.000 koloniebildende Einheiten robust nachweisbar waren, und es wurde eine lineare Korrelation zwischen den koloniebildenden Einheiten des Inokulums und der Biolumineszenz in vivo festgestellt. Die natürliche Entwicklung einer Harnwegsinfektion wurde in einer Kontrollgruppe untersucht, die keine Behandlung erhielt.
Die Wirkung einer Antibiotikabehandlung auf die Infektionskinetik wurde in einer Gruppe von mit Antibiotika behandelten Tieren detailliert visualisiert. Eine sofortige Abnahme der Bakterienlast, gemessen am Gesamtphotonenfluss, wurde nach der ersten Dosis von Enrofloxacin beobachtet. Keines der behandelten Tiere wies einen nachfolgenden Anstieg der Keimbelastung auf.
Die Gesamtbakterienbelastung jedes Tieres wurde anhand der Fläche unter der Kurve des logarithmisch transformierten Gesamtphotonenflusses berechnet, was einen signifikanten Unterschied zwischen tieren, die mit Enrofloxacin behandelt wurden, und unbehandelten Tieren im Laufe von 10 Tagen zeigte. Diese Ergebnisse liefern den Beweis für das Konzept, dass BLI verwendet werden kann, um Unterschiede in der Kinetik von Harnwegsinfektionen zu bewerten. Die Biolumineszenzbildgebung ist eine nichtinvasive Technik, die mit anderen Methoden wie der regelmäßigen Entnahme von Harnproben für die bakterielle oder biochemische Analyse oder für die Experimente kombiniert werden kann.
Hier haben wir gezeigt, dass die Biolumineszenz-Bildgebung ein leistungsfähiges Werkzeug ist, um neuartige therapeutische Strategien zum Krankheitsverlauf von Harnwegsinfektionen zu bewerten.
