הספירה של יחידות יצירת המושבה הגבילה את יכולת הרבייה של המחקר בתחום UTI. הדמיית ביו-לומינציה תתקדם במחקר VIVO UTI על פיזיולוגיה של שלפוחית השתן, פתוגנזה UTI ורגישות. הדמיית ביו-לומינציה מאפשרת מעקב אורך עם תובנה בזמן אמת על התפתחות הזיהום.
יתר על כן, זה מפחית באופן דרסטי את מספר בעלי החיים הדרושים. הדמיית ביולומינציה מקלה על מחקר על זיהומים חוזרים ונשנים או כרוניים, אשר שכיחים בבני אדם. בנוסף, חוקרים יכולים לזהות זיהומים עולים או להפיץ לדם באמצעות הדמיה ביו-לומינציה.
להשיג מושבות בודדות על ידי פסים את מלאי הגליצריל של חיידקים עם לולאת חיסון על לוחות LB בתוספת kanamycin סולפט, ו culturing לילה ב 37 מעלות צלזיוס. מלא צינור תחתון עגול סטרילי 14 מיליליטר פוליסטירן, עם כובעי הצמדה במיקום כפול עם חמישה מיליליטר של מרק LB בתוספת kanamycin גופרתי. בחר מושבה חיידקית אחת עם לולאת חיסון, והוסף את זה למרק LB.
מערבולת למשך 10 שניות כדי להבטיח ערבוב נכון. תרבות סטטית עם כובע הצמדה בעמדה הפתוחה ב 37 מעלות צלזיוס בן לילה. לאחר הדגירה, מערבולת הצינור במשך 10 שניות כדי להבטיח הומוגניזציה נכונה של התרבות החיידקית.
הפוך תת תרבות Erlenmeyer על ידי הוספת 25 microliters של השעיית חיידקים ל 25 מיליליטר של מדיום LB טרי ללא אנטיביוטיקה. סגור את ארלנמייר ותרבות סטטית בן לילה. ביום ההתקנה, לשפוך את התרבות מן Erlennmeyer לתוך צינור תרבות 50 מיליליטר, וצנטריפוגה.
דקאנט סופרנט ו resuspend הכדור החיידקי ב 10 מיליליטר של PBS סטרילי. מערבולת הצינור שוב במשך 10 שניות. בחר את הריכוז הניסיוני של inoculum ולקבוע את OD המתאים ב 600 ננומטר באמצעות העקומה הסטנדרטית.
הוסיף מיליליטר אחד של תרבית חיידקים resuspended לתוך תשעה מיליליטר של PBS סטרילי ולהתאים עד OD הרצוי 600 ננומטר הוא הגיע. הר קצה אנגיוקטטר סטרילי 24-מד על מזרק 100 מיקרוליטר. מלאו את המזרק בתמיסה החיידקית המוכנה.
מניחים חיה אחת על משטח עבודה בתנוחת העל-תשואה ושומרים על הרדמה איזופלוריין יציבה באמצעות חרוט אף במהלך ההתקנה. החל את משחת העין. לגרש את השתן שיורית על ידי החלת דחיסה עדינה וביצוע תנועות מעגליות על האזור suprapubic, ולאחר מכן לנקות את הבטן התחתונה עם 70%אתנול.
משמנים את קצה הצנתר עם תמיסת מלח רגילה. שים את האצבע המורה על היד הלא דומיננטית על הבטן ולדחוף אותו בעדינות כלפי מעלה. התחל את הצנתור של השופכה אנכית בזווית של 90 מעלות.
לאחר שנתקלים בהתנגדות, הטה אותה אופקית לפני הוספתה עוד יותר. בצע התקנה איטית של 50 מיקרוליטרים של inoculum חיידקי. לאחר ההתקנה, לשמור את המזרק ואת הצנתר במקום עוד כמה שניות ולאחר מכן לאט לסגת כדי למנוע דליפה.
השתמש צנתר אחד לכל קבוצת ניסוי. מקם את החיה בתנוחת על-חוש בקונוס האף כדי להכין אותו להדמיה, והכן אותו להדמיה באמצעות קטטר אחד לכל קבוצת ניסוי. במידת הצורך, לתת אנטיביוטיקה או תרופות ניסיוניות, כפי שהוזכר בכתב היד הטקסט.
פתחו את תוכנת הרכישה של BLI ולחצו על Initialize בהתקן ההדמיה כדי לבדוק את המצלמה ואת מערכת בקר הבמה ולקרר את מצלמת המכשיר מצמיד טעינה למינוס 90 מעלות צלזיוס. לחץ על רכישה, שמירה אוטומטית To.בחר זוהר ותמונה. בדוק את הגדרות הזוהר המהוות ברירת מחדל על-ידי הגדרת מסנן העירור כמסנן חסימה ופליטה כ'פתח'.
הגדר את זמן החשיפה באופן אוטומטי בעת צילום התמונה הראשונה. למדידות ויוו ולאותות בהירים, קבעו את זמן החשיפה לכ-30 שניות. צמצם את זמן החשיפה אם מופיעה אזהרה עקב תמונה רוויה.
בחר את הפח הבינוני, F/stop one ובחר את ה- FOV הנכון. הגדר את גובה הנושא לסנטימטר אחד בעת הדמיית עכברים. תמונה עד חמישה קילומטרים בו זמנית ולהפריד את בעלי החיים באמצעות בלבל האור כדי למנוע השתקפות.
סגור את הדלת ולחץ על רכישה כדי להתחיל את רצף ההדמיה, ולאחר מכן מלא מידע מפורט על הניסוי. מוציאים עכברים מתא ההדמיה ומחזירים אותם לכלוב שלהם. בדוק התאוששות מלאה לאחר הרדמה, ולאחר מכן להחזיר את הכלובים אל מתלים מאווררים עד מחזור ההדמיה הבא.
הפעל את תוכנת ההדמיה וטען את הקובץ הניסיוני על-ידי לחיצה על עיון. השתמשו בלוח הכלים להתאמת סרגל הצבעים של התמונה. השתמש בכלי ROI כדי לצייר אזור עניין בתמונה, להבטיח שהוא גדול מספיק כדי לכסות את האזור המלא ולהשתמש באותם ממדים עבור כל התמונות.
לאחר מכן לחץ על מדידת ROI כדי לכמת את עוצמת האור. תמונות מאוחרות יותר של עכברים שהושגו מיד לאחר ההתקנה הראו כי ניתן היה לזהות בחוזקה מעל 20, 000 יחידות יוצרות מושבה, ומתאם ליניארי בין המושבה היוצרת יחידות של inoculum ואת הביולומינציה ב vivo הוקמה. האבולוציה הטבעית של זיהום בדרכי השתן נחקרה בקבוצת ביקורת שלא קיבלה שום טיפול.
ההשפעה של טיפול אנטיביוטי על הקינטיקה של הזיהום הוצגה בפירוט בקבוצה של בעלי חיים שטופלו באנטיביוטיקה. ירידה מיידית בעומס החיידקים, כפי שנמדד על ידי שטף פוטון מוחלט, נראתה לאחר המנה הראשונה של Enrofloxacin. אף אחת מהחיות שטופלו לא סבלה מעלייה בעומס החיידקים.
העומס החיידקי הכולל של כל חיה חושב באמצעות האזור שמתחת לעקומת העץ הפך את שטף הפוטין הכולל, והראה הבדל משמעותי בין בעלי חיים שטופלו באנרופלוקסאצין לבין בעלי חיים לא מטופלים במהלך 10 ימים. תוצאות אלה מספקות הוכחה של מושג כי BLI יכול לשמש כדי להעריך הבדלים בקינטיקה זיהום UTI. הדמיית ביו-לומינציה היא טכניקה לא פולשנית שניתן לשלב עם שיטות אחרות כגון איסוף קבוע של דגימות שתן לניתוח חיידקי או ביוכימי או לניסויים.
כאן הוכחנו כי הדמיית ביולומינציה היא כלי רב עוצמה להערכת אסטרטגיות טיפוליות חדשניות על מהלך המחלה של דלקות בדרכי השתן.
