Koloni oluşturan birimlerin numaralandırılması, UTI alanındaki araştırmaların tekrarlanabilirliğini sınırlıyordu. Biyolüminesans görüntüleme mesane fizyolojisi, UTI patogenez ve duyarlılık üzerine vivo UTI araştırmalarında ilerleyecektir. Biyolüminesans görüntüleme, enfeksiyonun evrimi hakkında gerçek zamanlı içgörü ile boyuna takip sağlar.
Ayrıca, ihtiyaç duyulan hayvan sayısını büyük ölçüde azaltır. Biyolüminesans görüntüleme, insanlarda sık görülen tekrarlayan veya kronik enfeksiyonlar üzerine araştırmaları kolaylaştırır. Ek olarak, araştırmacılar biyolüminesans görüntüleme kullanarak artan enfeksiyonları veya kana yayılmayı tanımlayabilirler.
Kanamycin sülfat ile desteklenmiş LB plakalarında bir aşılama döngüsü ile bakteri gliserol stokunu çizgileyarak ve bir gecede 37 santigrat derecede kültleme yaparak tek koloniler elde edin. Steril 14 mililitrelik polistiren yuvarlak alt tüpü, kanamycin sülfat ile desteklenmiş beş mililitre LB suyu ile çift konumlu snap kapaklarla doldurun. Aşı döngüsü olan tek bir bakteri kolonisi seçin ve bunu LB suyuna ekleyin.
Uygun karıştırmayı sağlamak için 10 saniye boyunca girdap. Bir gecede 37 santigrat derecede açık konumda yapıştırı kapağı ile statik olarak kültür. Kuluçkadan sonra, bakteri kültürünün uygun homojenizasyonunu sağlamak için tüpü 10 saniye boyunca girdaplayın.
Antibiyotiksiz 25 mililitre taze LB ortamına 25 mikrolitre bakteri süspansiyonu ekleyerek Erlenmeyer'de bir alt kültür yapın. Erlenmeyer'i ve kültürü statik olarak bir gecede kapatın. Kurulum gününde, Erlennmeyer'deki kültürü 50 mililitrelik bir kültür tüpüne ve santrifüje dökün.
Süpernatantı deklare edin ve bakteri peletini 10 mililitre steril PBS'de yeniden dirsindirin. Tüpü 10 saniye boyunca tekrar vorteks edin. Inoculumun deneysel konsantrasyonu seçin ve standart eğriyi kullanarak 600 nanometrede karşılık gelen OD'yi belirleyin.
Yeniden dürtülen bakteri kültürünün bir mililitresini dokuz mililitre steril PBS'ye ekleyin ve istenen OD 600 nanometreye ulaşılana kadar ayarlayın. 100 mikroliter şırıngaya steril 24 kalibrelik bir anjiyokater ucu takın. Şırınd'ı hazırlanan bakteri çözeltisi ile doldurun.
Bir hayvanı destek pozisyonunda çalışan bir yüzeye yerleştirin ve kurulum sırasında bir burun konisi kullanarak kararlı bir izofluran anestezisi sağlayın. Göz merhemini uygulayın. Hafif sıkıştırma uygulayarak ve suprapubik bölgeye dairesel hareketler yaparak artık idrarı dışarı atın, ardından alt karnı% 70 etanol ile temizleyin.
Kateter ucunu normal salin ile yağlayın. İşaret parmağını karın üzerindeki baskın olmayan ele koyun ve hafifçe yukarı doğru itin. Üretranın kateterizasyonunu dikey olarak 90 derecelik bir açıyla başlatın.
Dirençle karşılaşıldıktan sonra, daha fazla yerleştirmeden önce yatay olarak eğin. Bakteriyel inoculumun 50 mikrolitresinin yavaş bir kurulumunu gerçekleştirin. Kurulumdan sonra, şırınna ve kateteri birkaç saniye daha yerinde tutun ve ardından sızıntıyı önlemek için yavaşça geri çek.
Deney grubu başına bir kateter kullanın. Hayvanı görüntülemeye hazırlamak için burun konisinde bir geri zeka pozisyonunda konumlandırın ve deney grubu başına bir kateter kullanarak görüntülemeye hazırlayın. Gerekirse, metin el yazmasında belirtildiği gibi antibiyotik veya deneysel ilaçlar sanın.
BLI alma yazılımını açın ve kamera ve sahne kontrol sistemini test etmek ve şarj bağlantılı cihaz kamerasını eksi 90 santigrat dereceye soğutmak için görüntüleme cihazında Başlat'a tıklayın. Edinme, Otomatik Kaydetme To.Select Luminescence ve Fotoğraf'a tıklayın. Heyecan filtresini Blok ve emisyon filtresini Aç olarak ayarlayarak varsayılan parlaklık ayarlarını denetleyin.
İlk görüntüyü çekerken pozlama süresini otomatik olarak ayarlayın. In vivo ölçümler ve parlak sinyaller için pozlama süresini yaklaşık 30 saniye olarak ayarlayın. Doymuş bir görüntü nedeniyle bir uyarı görüntülenirse pozlama süresini azaltın.
Orta binning, F/stop one'ı seçin ve doğru FOV'u seçin. Fareleri görüntülerken konu yüksekliğini bir santimetreye ayarlayın. Görüntü aynı anda beş mile kadar ve yansımayı önlemek için ışık şaşkınlık kullanarak hayvanları ayırın.
Kapıyı kapatın ve görüntüleme sırasını başlatmak için Edin'e tıklayın, ardından deney hakkında ayrıntılı bilgi doldurun. Fareleri görüntüleme odasından çıkarın ve kafeslerine geri verin. Anesteziden sonra tam iyileşme olup olmadığını kontrol edin, ardından kafesleri bir sonraki görüntüleme döngüsüne kadar havalandırılan raflara geri verin.
Görüntüleme yazılımını başlatın ve Gözat'a tıklayarak deneysel dosyayı yükleyin. Görüntünün renk ölçeğini ayarlamak için araç paletini kullanın. Görüntüye ilgi çekici bir bölge çizmek için yatırım getirisi araçlarını kullanın, alanın tamamını kaplayacak kadar büyük olmasını sağlayın ve tüm görüntüler için aynı boyutları kullanın.
Ardından ışık yoğunluğunu ölçmek için yatırım getirisi ölçümüne tıklayın. Kurulumdan hemen sonra elde edilen farelerin sonraki görüntüleri, 20.000 koloni oluşturan ünitenin üzerinde sağlam bir şekilde tespit edilebilen ve inoculumun koloni oluşturan birimleri ile in vivo biyolüminesans arasında doğrusal bir korelasyon kurulduğunu gösterdi. İdrar yolu enfeksiyonunun doğal evrimi, herhangi bir tedavi almayan bir kontrol grubunda çalışılmıştır.
Antibiyotik tedavisinin enfeksiyon kinetiği üzerindeki etkisi, antibiyotik tedavisi gören bir grup hayvanda ayrıntılı olarak görselleştirildi. Enrofloksasin'in ilk dozunda bakteriyel yükte, toplam foton akısı ile ölçüldüğünde hemen bir azalma görüldü. Tedavi edilen hayvanların hiçbirinde bakteri yükünde daha sonra bir artış olmadı.
Her hayvanın genel bakteri yükü, kütüğün eğrisi altındaki alan kullanılarak hesaplandı ve toplam foton akısını dönüştürdü ve 10 gün boyunca Enrofloksasin ile tedavi edilmeyen hayvanlar arasında önemli bir fark gösterdi. Bu sonuçlar, BLI'nin UTI enfeksiyon kinetiğindeki farklılıkları değerlendirmek için kullanılabileceğinin kavram kanıtını sağlar. Biyolüminesans görüntüleme, bakteriyel veya biyokimyasal analizler veya deneyler için idrar örneklerinin düzenli olarak toplanması gibi diğer yöntemlerle birleştirilebilen noninvaziv bir tekniktir.
Burada biyolüminesans görüntülemenin idrar yolu enfeksiyonlarının hastalık seyri üzerine yeni terapötik stratejileri değerlendirmek için güçlü bir araç olduğunu gösterdik.
