Воздействие стресса может вызвать агрегацию белка и привести к значительным изменениям в фенотипических поведения бактерий. Процедура, описанная в этом видео, позволяет экстракцию и визуализацию белковых агрегатов после лечения стресса. В отличие от других опубликованных процедур, этот протокол требует более низкого количества клеток и воздержания от сложных процессов физического нарушения, а также трудоемких этапов промывки и инкубации.
Этот протокол может быть использован для изучения агрегации белка у широкого спектра грамотрицательных и грамположительных бактерий. Вы также можете проанализировать влияние делеций генов или сравнить эффективность протеотоксических соединений. Начните с инокуляции одной колонии штамма E.coli MG1655 и уропатогенного штамма E.coli CFT073, каждый в пять миллилитров лизогенного бульона, или LB, среды.
Инкубировать две культуры бульона при 37 градусах Цельсия и 300 об/мин в течение 14-16 часов. Разбавьте каждый штамм до оптической плотности при 600 нанометрах, или OD600, 0,1 в 500-миллилитровую колбу, содержащую 70 миллилитров среды MOPS-g. Инкубируйте колбы при 37 градусах и 300 оборотах в минуту до достижения средней фазы бревна.
После инкубации переложите по 20 миллилитров каждой культуры в три предварительно нагретые 125-миллилитровые колбы и высиживают их при 37 градусах Цельсия и 300 об/мин в течение двух минут. Приготовьте раствор антимикробного соединения с двумя миллиграммами на миллилитр в среде MOPS-g. Добавляют этот раствор в каждую культуру для достижения желаемых концентраций, и добавляют необходимый объем среды MOPS-g для необработанных элементов контроля.
Определите OD600 каждой культуры после 45 минут лечения стрессом. Для каждого образца аликвотируют четыре миллилитра культуры с OD600 одного в 15-миллилитровые центрифужные трубки. Повторное суспендирование клеточных гранул в 50 микролитрах ледяного лизисного буфера.
Инкубировать образцы в течение 30 минут на льду. Добавьте к образцам 360 микролитров ледяного буфера А и аккуратно перемешайте путем пипетирования. Перенесите образцы в двухмиллилитрные микроцентрифужные трубки с примерно 200 микролитрами 0,5-миллиметровых стеклянных шариков.
Инкубировать трубки в течение 30 минут при восьми градусах Цельсия в термомиксе с встряхиванием при 1400 об/мин. Высиживать трубки на льду в течение пяти минут без встряхивания, чтобы осесть стеклянные шарики. Затем переложите 200 микролитров клеточного лизата в 1,7-миллилитровые микроцентрифужные трубки.
Центрифугируют клеточный лисат в течение 20 минут при 16 000 раз г и четырех градусах Цельсия. Соберите супернатант, который будет использоваться в качестве образца растворимого белка позже. Используйте пипетку для повторного суспендирования гранулы в 200 микролитрах ледяного буфера А.Центрифуга из пробирок в 16 000 раз в г и четырех градусах Цельсия в течение 20 минут.
Затем аккуратно удалите супернатант совсем. Используйте пипетку, чтобы аккуратно повторно суспендировать гранулу в 200 микролитрах ледяного буфера B.Центрифугировать трубки снова и аккуратно удалить супернатант. Затем повторите промывку с буфером A.Resuspend гранулу в 100 микролитров 1x уменьшающего буфера образца SDS и кипятите ее в течение пяти минут в ThermoMixer при 95 градусах Цельсия.
Смешайте один объем 100% TCA с четырьмя объемами растворимого образца белка, собранного ранее, и инкубировать в течение 10 минут при четырех градусах Цельсия для осаждения белка. Центрифугируют образец при 21 000 г и четырех градусах Цельсия в течение пяти минут, чтобы получить осадок, и удалите супернатант. Используйте 200 микролитров ледяного ацетона для промывки гранул, чтобы удалить клеточный мусор.
Центрифугировать образец снова, чтобы получить осадок, и удалить супернатант. Чтобы удалить оставшийся ацетон из гранул, держите трубки микроцентрифуги в ThermoMixer при 37 градусах Цельсия с открытыми крышками. Затем добавьте 100 микролитров 1x уменьшающего буфера SDS, чтобы полностью растворить гранулу, и кипятите образец при 95 градусах Цельсия в течение пяти минут.
Немедленно загрузите образец на полиакриламидный гель SDS для разделения или сохраните образец при минус 20 градусах Цельсия, чтобы продолжить позже. Подготовьте два разделительных геля, как описано в тексте рукописи. Налейте гель между стеклянными пластинами с помощью одномиллилитровой пипетки, убедив, что верхние два сантиметра свободны от смеси.
Добавьте 70% этанола поверх разделяющего геля, создавая равное взаимодействие между двумя слоями. После того, как разделяющие гели полимеризуются, подготовьте гели для укладки, используя инструкции в текстовой рукописи. Затем удалите этанол из разделяющих гелей и добавьте раствор геля для укладки.
Осторожно вставьте расческу с нужным количеством карманов, не вводя пузырьков воздуха, и дайте гелю полимеризоваться в течение 20-30 минут. Загрузите четыре микролитра каждого образца, а также белковую лестницу в отдельные скважины. Затем запустите гель в трис-глициновом буфере при 144 вольтах в течение 45 минут при комнатной температуре.
Используйте предварительно подогретый раствор Фэрбенкса А для окрашивания гелей на коромысле в течение 30 минут и предварительно подогретый раствор Фэрбенкса D для раскрашив гели на коромысле до тех пор, пока не будет достигнут желаемый фон. Наблюдалось увеличение количества белкового агрегата, образующегося при обработке клеток 175 микрограммами на миллилитр и 200 микрограммами на миллилитр противомикробного препарата, по сравнению с необработанными клетками. Увеличение нерастворимой белковой фракции было более выражено у более чувствительного штамма MG1655.
Снижение количества растворимых белков при обработке клеток 175 микрограммами на миллилитр и 200 мкг на миллилитр антимикробного препарата по сравнению с необработанными клетками. При попытке этого протокола имейте в виду, что нормализация оптической плотности на 600 нанометров важна для сравнения степени агрегации белка в образцах.
