이 프로토콜은 세포 내부의 리보솜 활동에 대한 분자 세부 사항을 나타내는 폴리솜 프로파일을 생성하는 방법을 설명합니다. 이 기술을 통해 사용자는 자동화된 그래디언트 분획 시스템에 액세스할 수 없는 폴리솜 프로파일에서 제공하는 귀중한 정보를 얻을 수 있습니다. 그래디언트를 준비하는 동안 시간을 할애하고 그래디언트가 선형 그래디언트로 정착할 때 압축기 또는 기타 기계적 작동에 의해 중단되지 않는 위치에 그래디언트를 보관하십시오.
시작하려면 자당 구배 완충액에 7 및 47 % 자당의 스톡 용액을 준비하십시오. 필터는 0.22 미크론 필터를 통해 자당 스톡 용액을 살균합니다. 14 밀리리터의 17, 27 및 37 % 스톡 용액을 분주하고 혼합하여 47 밀리리터의 7 및 47 % 자당 용액을 준비하십시오.
6개의 폴리프로필렌 원심분리기 튜브를 전체 보기 시험관 랙에 넣습니다. 한 튜브의 동작이 다른 튜브를 방해하지 않도록 튜브 사이에 충분한 공간이 있는지 확인하십시오. 끝이 뭉툭한 9인치, 22게이지 바늘을 3밀리리터 주사기에 부착하고 테스트 채우기 및 분배를 수행하여 주사기가 그라디언트를 설정하기 전에 물방울 없이 자당 용액을 담을 수 있는지 확인합니다.
각 원심 분리기 튜브의 바닥에 7 % 자당 2 밀리리터를 추가하십시오. 그런 다음 바늘 끝을 튜브 바닥 바로 근처에 위치시켜 7% 용액 아래에 17% 자당 2밀리리터를 추가합니다. 조심스럽게 천천히 용액을 분배하십시오.
27, 37 및 47 % 자당 용액 각각 2 밀리리터로 절차를 반복하여 각 층이 밀도 분리를 표시하는 선으로 서로 구별 될 수 있도록합니다. 그라디언트를 밤새 섭씨 4도에 보관하여 연속적이고 증가하는 자당 비율로 정착할 수 있도록 합니다. 효모의 성장 및 수확 후, 사카로마이세스 세레비지애 세포는 세포를 700 마이크로리터의 폴리솜 추출 완충액에 재현탁시킨다.
RNAse 억제제 100 단위를 추가하십시오. 그런 다음 대략 425-600 미크론 크기의 사전 냉각 유리 비드 400 마이크로 리터를 추가하십시오. 혼합물을 유리 비드와 함께 1.5 밀리리터 원심분리 튜브로 옮기고, 비드 비터에서 5분 동안 격렬하게 교반하여 효모 세포를 파괴한다.
세포를 파쇄한 후, 원심분리에 의해 용해물을 명확히 한다. 형광 기반 RNA 검출 시스템을 이용하여 260 나노미터에서 흡광도를 측정하여 정제된 용해물 내의 RNA 농도를 결정한다. RNA 농도가 마이크로리터당 0.5 내지 1마이크로그램인지 확인하십시오.
RNA 농도가 너무 낮으면 세포를 재현탁하는 데 사용되는 추출 완충액의 부피를 줄입니다. 용해물을 그라디언트 상단에 조심스럽게 로드합니다. 피펫 팁을 폴리프로필렌 튜브 상단의 내벽에 대고 놓습니다.
튜브의 각도를 맞추고 용해물을 그라디언트 상단에 천천히 분배하여 벽에 드리블합니다. 스윙 버킷 로터의 사전 냉각된 버킷에 튜브를 부드럽게 넣고 그라디언트를 원심분리합니다. 원심 분리 후 스윙 버킷 로터에서 원심 분리 튜브를 조심스럽게 제거하고 튜브 홀더에 넣습니다.
96웰 플레이트에 라벨을 붙여 분획을 저장하고 얼음에 미리 식힙니다. 그래디언트 상단에서 시작하여 피펫 팁을 그래디언트 상단에 조심스럽게 삽입하고 전체 그래디언트가 분획될 때까지 분수를 수집하여 그래디언트 상단에서 시작하여 100 또는 200마이크로리터 분획을 수집합니다. 분광 광도계로 254 나노 미터에서 각 분획의 흡광도를 블랭크로 7 및 47 % 자당 용액에 대해 측정합니다.
분수 대 흡광도를 플로팅하여 폴리솜 프로파일을 만듭니다. 효모 S.Cerevisiae로부터의 3개의 대표적인 폴리솜 프로파일이 도시되어 있다. 각 리보솜 서브 유닛과 폴리 솜 피크의 볏은 각 프로파일에서 분명합니다.
자동화된 밀도 분별 시스템의 대표적인 프로파일이 여기에 표시됩니다. 이 프로파일은 슈크로스 구배가 체이스 용액에 의해 아래에서 위로 변위되고, 검출기 유동 셀을 통해 분획으로 수집됨에 따라 연속 흡광도 프로파일로부터 생성되었다. 200 및 100 마이크로리터 샘플을 손으로 분획하여 생성된 폴리솜 프로파일이 여기에 나와 있습니다.
이 절차에서 기억해야 할 가장 중요한 것은 그라디언트를 방해하지 않는 것입니다. 기포가 유입되거나 용액을 너무 빨리 분배하여 그래디언트를 방해하지 않도록 주의하십시오. 이 절차에 따라 활성 리보솜과 관련된 mRNA를 결정하기 위해 추가 분석을 위해 구배에서 RNA를 추출할 수 있습니다.
