Этот протокол позволяет видеть различные типы культур и наблюдать за их взаимодействием с внеклеточной матрицей. Основным преимуществом этого метода является то, что матрица, которую вы получаете, регенерируется фибробластом, и она будет очень похожа на те, которые генерируются in vivo. Мы считаем, что эта болезнь не имеет значения при использовании фибробластов получения от выпечки блюд.
Создание матрицы из этих клеток может просветить нас, как это может повлиять, например, на устойчивую ситуацию. Эти методы также могут быть применены, например, к физическим исследованиям выживших из матрицы приличия. Визуализация этого протокола важно соблюдать технику пипетки шагов, которые вы должны регент.
При попытке этих методов в первый раз это, вероятно, займет больше времени, чем ожидалось. Наш совет заключается в том, чтобы подготовить как можно больше заранее и использовать периоды продолжительности для подготовки к следующим шагам. Начните с подготовки 0,2%желатина, 1%glutaraldehyde и один моляр этаноламин решения в соответствии с рукописными направлениями.
Убедитесь в том, чтобы запустить каждое решение через фильтр 0,22 микрометра перед использованием. Далее приготовьте аскорбиновую кислоту и лиз буфера. Разбавить PBS перо-strep, как описано в рукописи и подготовить DMEM с 10%FBS.
Приготовьте тепло-денатурированные 2%BSA, добавив 2 грамма BSA до 100 миллилитров стерильной воды и нагревая его в кипящей водяной бане в течение семи минут. Затем дополнить FBS пенициллином, стрептомицином, гентамицином и амфотерицином B.Culture рекомбинантными теломерами, трансфицированными увековеченными фибробластами человеческой крайней цыпы и DMEM с 10%FBS и поддерживать их при 37 градусах Цельсия и 5%углекислом газе. Чтобы установить первичную фибробластовую культуру, разрежьте образцы тканей на мелкие кусочки примерно из двух-трех миллилитров детенышей и посеять их в FPS с высокой концентрацией антибиотиков.
Когда появятся первые фибробласты, замените среду на FBM-среду для обслуживания клеток. Добавьте два миллилитров раствора 0,2% желатина в каждую колодец из шести хорошо пластины и инкубировать его в течение одного часа в течение 37 градусов по Цельсию или на ночь при четырех градусах по Цельсию. После инкубации, аспирировать желатин и мыть каждый хорошо с двумя миллилитров PBS.
Добавить два миллилитров 1% глутаралдегида к каждому хорошо и инкубировать пластины при комнатной температуре в течение тридцати минут, которые будут пересекать желатин. Аспирировать глутаралдегид и мыть скважины в два миллилитров PBS в течение пяти минут. Чтобы заблокировать оставшийся глутаралдегид, добавьте два миллилитров одного моларного этаноламина и инкубировать пластину при комнатной температуре в течение тридцати минут.
Аспирировать этаноламин и повторить моет с PBS. Добавьте один миллилитр DMEM с 10%FPS. Если среда сразу же становится розовым, удалите его, мыть колодцы один раз с двумя миллилитров PBS и добавить еще миллилитр DMEM.
Семя один миллилитр фибробластовой суспензии с 5 х 10 до пятой клетки в каждом хорошо и культуры клеток до 100% слияния не будет достигнуто. Затем удалите среду и замените ее DMEM 10%FBS и 50 микрограммами на миллилитр аскорбиновой кислоты. Замените носитель каждые два дня в течение шести дней.
Через два дня после последней обработки аскорбиновой кислоты удалить средний и мыть скважины с двумя миллилитров PBS. После мытья медленно добавьте один миллилитр разогретого буфера лиза и инкубировать пластину при комнатной температуре в течение пяти-десяти минут, пока фибробласты не будут обезжирено. Не снимая буфер лиза, аккуратно добавьте два миллилитров PBS к каждому хорошо, а затем аспирировать примерно 2,5 миллилитров.
Повторите этот процесс дважды в общей сложности три моет. После окончательной стирки добавьте два миллилитров PBS с ручкой-strep. Печать пластины с пленкой и держать его на четыре градуса по Цельсию на срок до трех месяцев.
Выращиваем клетки HUVEC и EMB-2 с 2%FBS до максимального слияния. Затем замените носитель EBM-2 без FBS в течение восьми часов. Чтобы подготовить матрицы для посева клеток, удалите их из холодильника и оставьте их при комнатной температуре на один час.
Заблокив матрицы, добавьте два миллилитров тепловых 2%BSA и инкубировать их при температуре 37 градусов по Цельсию в течение одного часа. Затем, аспирировать BSA и мыть их с двумя миллилитров PBS. Семя 2 х 10 до пятого HUVEC клеток к каждому хорошо пластины покрыты фибробластов полученных матриц.
Инкубировать клетки при 37 градусах по Цельсию в течение 16 часов, а затем изучить трубчатые структуры под стандартным ярким полевым микроскопом при 20-40x увеличении. Этот протокол был использован для изучения влияет на лечение PDGF на фибробластов полученных матричного образования. Третие фибробласты BGH, которые были инкубированы PDGF, показали более выровненную распределение клеток в матрицах, чем те, которые инкубировались без PDGF.
Выражение коллагена 1 и фибронектина белка было увеличено в матрицах, полученных из PDGF-стимулированных фибробластов и, следовательно, толщина матрицы была увеличена. Кроме того, гистограммы направленности показывают, что коллаген 1 и фибронектин показывают параллельные узоры. Когда клетки HUVEC были посеяны на децеллюляризованных матриц, полученных из PDGF-стимулировали фибробласты они разработали более капиллярных структур, чем ни при каких стимулировали условиях.
Подтверждение того, что матрицы, полученные из PDGF-BB стимулировали фибробласты способствовать активации эндотелиальных клеток. При выполнении этой процедуры важно заранее подготовить решения и убедиться, что клетки готовы перед запуском. Кроме того, эндотелиальные клетки исследования матрицы также могут быть посеяны с эпителиальными клетками и реакция на внешние факторы, такие как состояние в средствах массовой информации или цитотоксических препаратов можно наблюдать.
Поколение внеклеточной матрицы имеет решающее значение при разработке экспериментов по макроокниронированию опухоли.
