Этот протокол важен, потому что это оптогенетический или активированный светом метод для индуцирования экспрессии генов в интактном организме. В нашем случае эмбрион рыбки данио. Преимущество этого метода заключается в том, что он использует свет в качестве индуцатора, что позволяет очень точно, пространственно и временно контролировать индукцию.
Этот протокол был бы полезен для любой ситуации, когда индуцируемая экспрессия генов была бы полезна. Это включает в себя такие вещи, как отслеживание родословной, анализы на получение функции или спасательные эксперименты. Для начала расположите светодиодную панель относительно чаш Петри, содержащих эмбрионы, для доставки 1,5 милливатт на квадратный сантиметр мощности света сразу нескольким эмбрионам.
Для снижения риска повреждения фотографии активатора tail Transcriptional, размещайте свет с интервалом в один час включения-выключения с помощью реле таймера, если оно освещено более трех часов. Снимите крышки чашки Петри, чтобы свести к минимуму рассеяние света от конденсации. Поместите чашки Петри, содержащие контрольные эмбрионы, и светонепроницаемый ящик для темных элементов управления.
Удалите эмбрионы из иллюминации, после желаемой продолжительности активации. Для полной экстракции РНК используйте набор для экстракции РНК. Перенесите эмбрионы в 1,5-миллилитрную микроцентрифужную трубку и удалите лишнюю яичную воду.
После добавления буфера лизиса гомогенизируйте эмбрионы пластиковым пестиком. Перенесите лисат в комплект, предусмотренный колонкой, и следуйте инструкциям производителя по очистке РНК. Храните очищенную РНК при температуре от минус 20 до минус 80 градусов Цельсия до момента использования или немедленно синтезируйте кДНК из одного микрограмма, общей РНК с использованием набора синтеза кДНК, следуя инструкции производителя.
Добавьте один микрограмм РНК в тонкую стенку 0,2 миллилитра, ПЦР-трубку, содержащую четыре микролитра, пятикратной мастер-смеси реакции кДНК, с последующим добавлением одного микролитра, 20-кратного раствора фермента обратной транскриптазы. Затем составьте окончательный объем в 20 микролитров, с водой без нуклеаз. Поместите трубку в программированный термоциклер для синтеза кДНК.
Храните синтезированную кДНК при минус 20 градусах Цельсия до момента использования или немедленного использования для количественной оценки. Настройте количественные реакции ПЦР, содержащие кибер-зеленую ферментную мастер-смесь. Пятикратно разбавляют праймеры кДНК и ГФП при 325 наномолярной концентрации в трипликатах и проводят реакцию в запрограммированной машине ПЦР реального времени.
По завершении реакции проанализируйте кривую расплава для определения специфичности реакции. Рассчитайте индукцию, активируемую светом, по мере изменения складок относительно контрольных эмбрионов с помощью метода двойной дельта-КТ. И использовать статистическое программное обеспечение для определения значимости.
После удаления эмбрионов из освещения обездвиживайте эмбрионы для визуализации в 3% метилцеллюлозе, содержащей 0,01% трикаина в стеклянных депрессивных слайдах. Получайте флуоресцентные и яркие изображения на флуоресцентном стереомикроскопе, подключенном к цифровой камере, с помощью стандартных настроек фильтра GFP. Объединяйте изображения яркого поля и флуоресценции после получения с помощью программного обеспечения для обработки изображений.
Количественная оценка экспрессии GFP показала индукцию экспрессии уже через 30 минут после воздействия синего света. Затем уровни экспрессии GFP продолжали увеличиваться до шести часов, после активации неуклонно. Индукция GFP также была качественно оценена путем изучения интенсивности флуоресценции в то же время в точках после активации.
Флуоресценция GFP выше фоновых уровней впервые наблюдалась через три часа после активации и стала заметно ярче через шесть часов после активации. В отличие от контрольных эмбрионов за все временные точки, хранимые в темноте, не проявляли какой-либо заметной флуоресценции GFP. Активирующий свет должен находиться в синем диапазоне спектра видимого света.
Как свет комнаты, так и солнечный свет содержат некоторое количество синего света. Поэтому позаботьтесь о защите ваших негативных элементов управления от любых источников окружающего освещения. Система TAEL C120 генетически закодирована и модульна и может управлять экспрессией любого гена, представляющим интерес.
Таким образом, в сочетании с другими методами, он может быть использован для ответа на ряд биологических вопросов.
