このプロトコルは、遺伝子発現をインタクトな生物に誘導するための光遺伝学的、または光活性化方法であるため、重要である。私たちの場合、ゼブラフィッシュ胚。この技術の利点は、誘導の非常に正確な、容量および時間的制御を可能にする誘導剤として、光を使用することである。
このプロトコルは、誘導可能な遺伝子発現が有用であろうあらゆる状況に有用であろう。これには、系統トレース、機能獲得アッセイ、レスキュー実験などがあります。まず、一度にいくつかの胚に光の平方センチメートルの1.5ミリワットの電力を提供するための胚を含むペトリ皿に対するLEDパネルを位置付けます。
テール転写アクティベーターの写真損傷のリスクを低減するには、タイマーリレーを使用して1時間のオンオフ間隔で光をポストします(3時間以上照らす場合)。ペトリ皿の蓋を取り外して、結露による光の散乱を最小限に抑えます。コントロール胚と暗いコントロールのための防明箱を含むペトリ皿を置きます。
希望の活性化持続時間の後に、照明から胚を取り除きます。RNAの全抽出には、RNA抽出キットを使用してください。胚を1.5ミリリットルのマイクロ遠心分離チューブに移し、余分な卵水を取り除きます。
リシスバッファーを追加した後、プラスチックの害虫で胚を均質化します。ライセートをキットに移し、メーカーの指示に従ってRNAを精製します。精製されたRNAを、マイナス20〜マイナス80°Cで保存し、1マイクログラムからcDNAを使用するか、またはすぐに合成するまで、cDNA合成キットを使用して全RNAを、製造業者の指示に従うことによって保管する。
薄い壁に0.2ミリリットル、PCRチューブ、5回のcDNA反応マスターミックス、1マイクロリットルの添加、20倍の逆転写酵素酵素溶液の薄い壁にRNAの1マイクログラムを追加します。次に、ヌクレアーゼを含まない水で20マイクロリットルの最終容積を構成する。cDNA合成のためのプログラムされたサーモサイクラーにチューブを置きます。
使用するか、またはすぐに定量的評価に使用するまで、合成されたcDNAをマイナス20°Cで保存します。サイバーグリーン酵素マスターミックスを含む定量PCR反応を設定します。325ナノモル濃度で325ナノモル濃度で5倍希釈されたcDNAおよびGFPプライマーは、プログラムされたリアルタイムPCRマシンで反応を行います。
反応が完了したら、メルト曲線を分析して反応特異性を決定します。二重デルタCT法を用いて、コントロール胚に対するフォールド変化として光活性化誘導を計算する。そして、統計ソフトウェアを使用して有意性を判断します。
照明から胚を除去した後、ガラスうつ病スライドで0.01%トリカインを含む3%メチルセルロースでイメージング用の胚を固定化する。標準GFPフィルタ設定を使用して、デジタルカメラに接続された蛍光ステレオ顕微鏡で蛍光画像と明視野画像を取得します。取得後の明視野画像と蛍光画像を画像処理ソフトウェアとマージします。
GFP発現の定量化は、青色光暴露後30分で発現誘導を示した。GFP発現のレベルは、その後、着実に後活性化、6時間まで増加し続けました。GFP誘導はまた、活性化後のポイントと同時に蛍光強度を調べることによって定性的に評価した。
バックグラウンドレベルを超えるGFP蛍光は、最初に活性化後3時間で観察され、6時間の後活性化で顕著に明るくなった。対照的に、すべての時間ポイントに対する対照胚は、暗所に保たれ、示さなかった、任意のかなりのGFP蛍光を示した。活性化光は可視光スペクトルの青色の範囲になければなりません。
部屋の光と日光の両方に青色の光が含まれています。だから、任意の周囲の光源からあなたの負のコントロールを保護するために注意してください。TAEL C120システムは、遺伝的にコードされ、モジュラーであり、関心のある任意の遺伝子の発現を駆動することができる。
したがって、他の技術と組み合わせることで、様々な生物学的な質問に答えるために使用することができます。
