פרוטוקול זה הוא משמעותי מכיוון שהוא שיטה אופטוגנטית, או מופעלת לאור, לביטוי גנים, באורגניזם שלם. במקרה שלנו, עובר דג זברה. היתרון של טכניקה זו, הוא שהיא משתמשת באור, כסוכן גרימת, המאפשר שליטה מדויקת מאוד, מרווחית וטמפורלית של אינדוקציה.
פרוטוקול זה יהיה שימושי עבור כל מצב שבו ביטוי גנים לא ניתן לתפוקה יהיה שימושי. זה כולל דברים כמו מעקב אחר שושלת, בדיקת רווח או ניסויי הצלה. ראשית, מיקום לוח ה-LED ביחס לצלחות הפטרי המכילות עוברים להעברת 1.5 מילי-וואט לסנטימטר מרובע של אור למספר עוברים בו-זמנית.
להפחתת הסיכון לפגיעה בתמונה ל- Tail Transcriptional Activator, הצב את האור במרווחי זמן של שעה אחת מופעלת באמצעות ממסר טיימר, אם הוא מואר במשך יותר משלוש שעות. הסר מכסי צלחת פטרי כדי למזער את פיזור האור מן ה עיבוי. הניחו מנות פטרי המכילות עוברי בקרה וקופסה חסינת אור לבקרות כהות.
הסר עוברים מהארת, לאחר משך ההפעלה הרצוי. לחילוץ RNA כולל, השתמש בערכת חילוץ RNA. מעבירים את העוברים לצינור צנטריפוגה זעיר של 1.5 מיליליטר ומסירים את עודפי מי הביצה.
לאחר הוספת חוצץ תמוגה, הומוגניזציה העוברים עם עלי פלסטיק. העבר את ה- lysate לעמודה שסופקה ובצע את הוראות היצרן לטיהור RNA. אחסן את הרנ"א המטוהר, במינוס 20 עד מינוס 80 מעלות צלזיוס, עד לשימוש או לסנתז מיד את cDNA ממיקרוגרם אחד, סה"כ RNA באמצעות ערכת הסינתזה של cDNA, על ידי ביצוע ההוראה של היצרן.
הוסף מיקרוגרם אחד של RNA לקיר דק 0.2 מיליליטר, צינור PCR, המכיל ארבעה microliters, של חמש פעמים cDNA תגובה מאסטר תערובת, ואחריו תוספת של microliter אחד, של 20 פעמים פתרון אנזים transcriptase הפוך. הבא לפצות נפח סופי של 20 microliters, עם מים ללא נוקלאז. מניחים את הצינור במתכנת תרמו מחזור לסינתזה של cDNA.
יש לאחסן את ה-cDNA המסונתז במינוס 20 מעלות צלזיוס עד לשימוש או לשימוש מיידי להערכה כמותית. הגדר את תגובות ה- PCR הכמותיות המכילות תערובת מאסטר אנזימים ירוקים בסייבר. חמישה פריימרים מדוללים cDNA ו- GFP בריכוז של 325 ננומולאר במשולשים ומנהלים את התגובה במכונת PCR מתוכנתת בזמן אמת.
עם השלמת התגובה, לנתח את עקומת ההיתוך כדי לקבוע את הספציפיות התגובה. חשב אינדוקציה המופעלת באמצעות אור כשינוי קיפול ביחס לעוברי הבקרה בשיטת Delta CT הכפולה. ולהשתמש בתוכנה סטטיסטית כדי לקבוע את המשמעות.
לאחר הסרת העוברים מהארה, לשתק עוברים להדמיה ב 3%methylcellulose המכיל 0.01%Tricaine בשקופיות דיכאון זכוכית. השג תמונות פלואורסצנטיות ותמונות בהירות במיקרוסקופ סטריאו פלואורסצנטי המחובר למצלמה דיגיטלית באמצעות הגדרות מסנן GFP סטנדרטיות. מזג תמונות Brightfield ופלואורסצנטיות לאחר הרכישה עם תוכנת עיבוד תמונה.
כימות של ביטוי GFP הצביע על אינדוקציה של ביטוי ברגע 30 דקות לאחר החשיפה לאור הכחול. רמות ביטוי GFP אז המשיך לגדול עד שש שעות, לאחר ההפעלה בהתמדה. אינדוקציה GFP הוערך גם באופן איכותי על ידי בחינת עוצמת הפלואורסצנטיות בו זמנית נקודות לאחר ההפעלה.
פלואורסצנטיות GFP מעל רמות הרקע נצפתה לראשונה בשלוש שעות לאחר ההפעלה והפכה בהירה יותר באופן ניכר בשש שעות לאחר ההפעלה. לעומת זאת, עוברים שולטים בכל נקודות הזמן, נשמרים בחושך, לא הציגו, שום פלואורסצנטיות GFP ניכרת. האור המפעיל חייב להיות בטווח הכחול של ספקטרום האור הנראה.
אור החדר ואור השמש מכילים אור כחול. אז הגן על הבקרות השליליות שלך ממקורות אור סביבתיים. מערכת TAEL C120, מקודדת גנטית ומודולרית ויכולה להניע ביטוי של כל גן מעניין.
אז, בשילוב עם טכניקות אחרות, זה יכול לשמש כדי לענות על מגוון של שאלות ביולוגיות.
