이 프로토콜은 유전자 발현을 유도하기 위한 광 유전적 또는 빛 활성화 방법이기 때문에, 그대로 유기체에서 중요하다. 우리의 경우, 제브라피쉬 배아. 이 기술의 장점은 빛을 유도제로 사용하여 유도제로서 매우 정밀하고 간격적이며 시간적 제어를 가능하게 한다는 것입니다.
이 프로토콜은 유도 가능한 유전자 발현이 유용할 수 있는 모든 상황에 유용합니다. 여기에는 계보 추적, 기능 증가 에세이 또는 구조 실험과 같은 것들이 포함됩니다. 한 번에 여러 배아에 빛의 평방 센티미터 전력 1.5 밀리와트를 전달하기위한 배아를 포함하는 페트리 접시에 비해 LED 패널을 배치로 시작합니다.
테일 레태킹 액티비테이터에 대한 사진 손상 위험을 줄이려면 타이머 릴레이를 사용하여 1시간 간격으로 라이트를 3시간 이상 조명하는 경우 게시합니다. 페트리 접시 뚜껑을 제거하여 응축에서 빛이 산란되는 것을 최소화합니다. 제어 배아가 들어 있는 페트리 접시와 어두운 컨트롤을 위한 광방지 상자를 놓습니다.
원하는 활성화 기간 후에 조명에서 배아를 제거하십시오. 총 RNA 추출의 경우 RNA 추출 키트를 사용하십시오. 배아를 1.5 밀리리터 마이크로 원심분리기 튜브로 옮기고 과도한 달걀 물을 제거합니다.
리시스 버퍼를 추가한 후, 태아를 플라스틱 봉제물로 균질화합니다. 용양을 제공된 컬럼으로 옮기고 제조업체의 지시에 따라 RNA를 정화합니다. 정제 된 RNA를 영하 20 ~ 영하 80도에서 저장하여 제조업체의 지시에 따라 cDNA 합성 키트를 사용하여 cDNA를 사용하거나 즉시 합성 할 때까지 저장합니다.
얇은 벽 0.2 밀리리터, PCR 튜브에 RNA 1마이크로그램을 넣고 4개의 마이크로리터를 함유하고, 5회 cDNA 반응 마스터 믹스를 포함하고, 그 다음에 는 20배의 역전사 효소 용액의 1개의 마이크로리터를 첨가한다. 다음으로 20 마이크로리터의 최종 부피를 구성하고 핵이 없는 물로 만듭니다. cDNA 합성을 위해 프로그래밍된 열 순환기에 튜브를 배치합니다.
합성 된 cDNA를 사용 하거나 즉시 정량적 평가에 사용할 때까지 섭씨 영하 20도에 저장합니다. 사이버 녹색 효소 마스터 믹스를 포함하는 정량적 PCR 반응을 설정합니다. 5배 희석 cDNA 및 GFP 프라이머325 나노몰라 농도에서 트리클리케이트및 프로그래밍된 실시간 PCR 기계에서 반응을 수행한다.
반응이 완료되면 용융 곡선을 분석하여 반응 특이성을 결정합니다. 이중 델타 CT 방법을 사용하여 대조배아에 비해 접기 변화로 광 활성화 유도를 계산합니다. 그리고 통계 소프트웨어를 사용하여 중요성을 결정합니다.
조명에서 배아를 제거 한 후, 유리 우울증 슬라이드에서 0.01 %의 트리카인을 포함하는 3 %의 메틸 셀룰로오스에서 이미징을위한 배아를 고정합니다. 표준 GFP 필터 설정을 사용하여 디지털 카메라에 연결된 형광 스테레오 현미경으로 형광 및 밝은 필드 이미지를 획득하십시오. 이미지 처리 소프트웨어와 인수 후 밝은 필드와 형광 이미지를 병합합니다.
GFP 발현의 정량화는 청색광 노출 후 30분 만에 표현의 유도를 나타냈다. 그런 다음 GFP 발현의 수준은 최대 6시간까지 계속 증가했으며, 사후 활성화는 꾸준히 증가했습니다. GFP 유도는 또한 활성화 후 동시에 응광 강도를 검사하여 질적으로 평가되었다.
배경 수준 위의 GFP 형광은 처음 활성화 후 3 시간에서 관찰되었고 6 시간 후 활성화에서 눈에 띄게 밝아졌습니다. 대조적으로 모든 시간 지점에 대한 제어 배아는 어둠 속에서 유지, 전시하지 않았다, 어떤 감사 GFP 형광. 활성화 광은 가시광선 스펙트럼의 파란색 범위에 있어야 합니다.
객실 조명과 햇빛 에는 파란색 표시등이 모두 있습니다. 따라서 주변 광원으로부터 부정적인 컨트롤을 보호하십시오. TAEL C120 시스템은 유전적으로 인코딩되고 모듈식이며 관심 있는 유전자의 발현을 유도할 수 있습니다.
그래서, 다른 기술과 결합, 그것은 생물학적 질문의 범위에 대답하는 데 사용할 수 있습니다.
