Инициация апоптоза опосредована активацией каспаз на маркерных молекулярных платформах. Представлено обнаружение ключевого инициационного клеточного комплекса гибели DISC, который служит платформой для активации каспазы-8. Преимущество данной методики в том, что она позволяет обнаруживать сборку и состав комплекса DISC наряду с предоставлением информации об обработке каспазы-8 в данном комплексе.
Начните эксперимент с клетками, которые на 80-90% сливаются и прилипают к блюду. Выбросьте среду и добавьте свежую среду в клетки адгезивов. Затем стимулируют клетки выбранной концентрацией CD95L, удерживая пластинку под углом и пипетируя лиганд в среду, не касаясь адгезивных клеток.
Чтобы собрать клетки, поместите чашку из клеток на лед. Добавьте 10 миллилитров холодного PBS в суспензию ячейки и соскоблите прикрепленные ячейки с пластины. Соберите клеточную суспензию в 50-миллилитровую трубку.
Дважды вымойте посуду с 10 миллилитрами холодного PBS и добавьте раствор для мытья в ту же 50-миллилитровую трубку. Затем центрифугируют клеточную суспензию в 500 раз G в течение пяти минут при четырех градусах Цельсия. После выброса супернатанта повторно суспендируют ячейку гранулы в одном миллилитре холодного PBS.
Затем переложите клеточную суспензию в 1,5-миллилитровую трубку. Центрифугируйте клеточную суспензию и повторно суспендируйте гранулу ячейки в одном миллилитре холодного PBS снова. Повторите центрифугирование еще раз, затем повторно суспендируйте гранулу клетки в одном миллилитре лизисного буфера и инкубируйте ее в течение 30 минут на льду.
После инкубации центрифугируют лизат с максимальной скоростью в течение 15 минут при четырех градусах Цельсия, затем переносят супернатант в чистую трубку. Выбросьте гранулу и соберите 50-микролитровой образец лизата в другую пробирку для определения концентрации белка. Для иммунопреципитации добавьте к лизату два микролитра антитела против АПО1 и 10 микролитров подготовленных шариков сефарозы белка А.
Добавьте 10 микролитров только бисера в отдельную трубку, содержащую лизат, чтобы служить в качестве контроля бисера. Инкубируйте смесь, содержащую лизат, антитела и бусины сефарозы белка А в течение ночи при четырех градусах Цельсия с мягким перемешиванием. На следующий день центрифугируйте смесь в 500 раз в G в течение четырех минут при четырех градусах Цельсия.
После выброса супернатанта вымойте шарики, добавив один миллилитр холодного PBS и выбросив супернатант после центрифугирования. Повторите этот шаг не менее трех раз. После отказа от последней промывки PBS аспирируйте бусины предпочтительно шприцем Гамильтона объемом 50 микролитров.
Чтобы выполнить вестерн-блот, добавьте 20 микролитров 4-кратного загрузочного буфера в бусины и нагревайте при 95 градусах Цельсия в течение 10 минут. Одновременно нагревайте контроль лизата при 95 градусах Цельсия в течение пяти минут. Загрузите лизаты, иммунопреципитанты и белковый стандарт на гель SDS 12,5% и работайте с постоянным напряжением 80 вольт.
После того, как гель будет завершен, перенесите белки из геля SDS в нитроцеллюлозную мембрану. После того, как перенос будет завершен, поместите промокшую мембрану в коробку и высиживайте ее в течение часа в блокирующем растворе под мягким перемешиванием, затем трижды промывайте мембрану в течение пяти минут PBST. Для обнаружения белков добавляют первое первичное антитело в указанном разведении к мембране и инкубируют его в течение ночи при четырех градусах Цельсия с мягким перемешиванием.
На следующий день промыть мембрану тремя пятиминутными промывками PBST, затем инкубировать мембрану с 20 миллилитрами вторичного антитела с легким встряхиванием в течение одного часа при комнатной температуре. Снова промыть мембрану три раза ПБСТ. После отказа от последней промывки PBST добавьте примерно один миллилитр субстрата пероксидазы хрена к мембране и обнаружите сигнал хемолюминесценции.
Стимуляция клеток рака шейки матки HeLa-CD95 с помощью CD95L привела к высокому уровню образования CD95 DISC, контролируемому с помощью иммунопреципитации CD95. CD95, FADD, прокаспаза-8, прокаспаза-10 и c-FLIPS наблюдались в этих иммунопреципитациях CD95, указывающих на эффективное формирование DISC. Продукты расщепления p43-FLIP и p22-FLIP были обнаружены в иммунопреципитациях, что указывает на активацию каспазы-8.
Клетки HeLa-CD95, которые чрезмерно экспрессируют c-FLIP в течение длительного времени, были использованы для анализа образования CD95 DISC. Подобно родительским клеткам HeLa-CD95, в иммунопреципитациях этих клеток без лечения CD95L не было обнаружено рекрутирования белков FADD, прокаспазы-9, прокаспазы-10, c-FLIP и PARP1. Активированные первичные Т-клетки характеризовались высокими уровнями CD95, FADD, прокаспазы-8, прокаспазы-10 и c-FLIPS в иммунопреципитациях против CD95.
Этот метод позволяет анализировать молекулярное образование DISC, включая обработку каспазы-8 на DISC. Все этапы стирки очень важны. Кроме того, следует серьезно относиться к точкам стимуляции и времени инкубации.
Только так можно измерить сборку на комплексе DISC. Однако для измерения активации каспазы-8 можно также проводить анализы активности каспазы-8. Такой подход позволил нам получить новое понимание инициации апоптоза.
