Ангиогенез играет важную роль в метастазах и прогрессировании опухоли. В этом протоколе мы будем использовать метод двойной биолюминесценции для мониторинга динамического прогрессирования опухоли и ангиогенеза в мышиной модели рака молочной железы. В этой модели мы можем отслеживать рост опухоли и ангиогенез одновременно в одной мыши через Светлячок люциферазы и Ренилла люцифераза изображения, соответственно.
Эта модель может быть широко применена в противоопухолевных скрининга наркотиков и онкологических исследований. Эта двойная модель биолюминесценции может быть использована для отслеживания прогрессирования и регрессии опухоли и обнаружения молекулярных процессов, связанных с опухолью, в ответ на терапевтические стратегии. Ангиогенез является важнейшим процессом прогрессирования опухоли.
Поэтому мониторинг прогрессирования опухоли и ангиогенеза на визуальной и чувствительной основе необходим для разработки эффективных методов лечения опухоли. Процедуры продемонстрируют Кайюэ Чжан, Чэнь Ван и Шан Чэнь, студенты из нашей лаборатории. Для упаковки лентивируса и производства семян один раз от 10 до шестого из 293T клеток в двух миллилитров DMEM дополняется 10% плода бычьей сыворотки на а в шесть хорошо пластины для ночной культуры во влажном инкубаторе при 37 градусов по Цельсию и 5%углекислого газа.
На следующее утро смешайте 7,5 микролитров липосомы с 250 микролитров минимальной существенной среды в двух отдельных 1,5-миллилитровых трубках в течение пяти минут инкубации при комнатной температуре. Для подготовки ДНК-решений добавьте плазмидный лентивирусный вектор RR и плазмиды помощников в 250 микролитров минимальной существенной среды в отдельных 1,5-миллилитровых трубках, как указано в таблице. В конце инкубации аккуратно добавьте растворы DNA RR в липосомные суспензии в капле-мудрый образом и позволить ДНК связи с липидными мембранами в течение 20 минут при комнатной температуре.
В то время как смесь инкубации, заменить супернатант 293T клеточной культуры с одним миллилитр свежей среды культуры, и осторожно добавить 0,5 миллилитров соответствующей липосомы смеси ДНК к каждому хорошо. Верните клетки в инкубатор клеточной культуры в течение 12-16 часов, прежде чем заменить супернатант в каждом хорошо с одним миллилитром свежей культуры среды, дополненной антибиотиками. После дополнительных 36 часов инкубации, объединить супернатанты в одну коническую трубку на штамм лентивируса, чтобы от осадки 293T клеток центрифугации.
Затем перенесите лентивирус RR-содержащие супернатанты в отдельные 1,5-миллилитровые стерильные полипропиленные трубки для хранения при температуре минус 80 градусов по Цельсию. Для лентивирусной трансдукции для экспрессии генов в клетках молочной опухоли 4T1, замените супернатант в каждом хорошо из шести-хорошо 4T1 клеточной культуры пластины с одним миллилитром свежих RPMI основе клеточной культуры среды дополняется фетальной сыворотки крупного рогатого скота и один миллилитр лентивирусного бульона. Затем добавьте восемь микрограмм на миллилитр полибрена к каждой хорошо, и осторожно пипетки несколько раз, чтобы смешать.
Центрифуга пластины, чтобы помочь увеличить эффективность трансдукции, и вернуть клетки в инкубатор культуры клеток в течение четырех-12 часов. В конце инкубации замените супернатант в каждом хорошо со свежей культурой среды, дополненной сывороткой и антибиотиками, чтобы удалить любые лентивирусные частицы и полибрен. Чтобы выбрать для лентивирусных транспонированных клеток, прохождение транс индуцированных 4T1 клеточных культур на один-к-три к одному-четыре соотношение со средним выбором, изменение среды каждые два-три дня.
После семи дней отбора средней культуры, просматривать транс индуцированных клеточных культур под флуоресценции перевернутой фазы контрастного микроскопа и подсчитать количество красных флуоресцентных белков-положительных или RFP-4T1 клеток и всех клеток 4T1 в трех областях зрения для оценки RFP-положительное соотношение. Чтобы создать модель опухолевых мышей, вымойте 80% стеченных трансфуцированных клеточных культур с PBS, прежде чем отделить клетки с двумя миллилитров трипсина-ЭДТА на 60-миллиметровую культурную пластину. Когда клетки подняли с дна пластины остановить реакцию с 5 до 10 миллилитров сыворотки дополняется среды на тарелку.
И перенести культуры в отдельные 15-миллилитровые центрифуги труб для подсчета. Разбавить клетки в один раз от 10 до шестой клетки на 100 микролитров среды культуры без концентрации сыворотки. А подкожно вводят 100 микролитров клеточной линии 4T1-RR в левое плечо обезболивающей опухоленосной модели мыши и 100 микролитров клеточной линии 4T1-RRT в правое плечо той же мыши.
После инъекций поместите каждую мышь в соответствующую зону восстановления с тепловой поддержкой до полного выздоровления. Пальпировать опухолевые массы каждый день в течение семи дней, чтобы подтвердить, что мыши опухолевых. На седьмой день после имплантации интраперитонно вводят по 50 микрограммов на килограмм Ганцикловира в каждую опухоленосную мышь два раза в день до окончания эксперимента.
Для роста опухоли откройте систему живой визуализации. Инициализируйте программное обеспечение Living Imaging и инициализируйте систему. В то время как система инициализируется, используйте инсулиновый шприц, чтобы ввести каждую мышь, чтобы быть изображены с соответствующим объемом coelenterazine в ретробульбар.
Поместите инъекционных мышей в камеру камеры и сразу же получить несколько фотографий мыши dorsally приобрести Ренилла люцифераза сигналы от 4T1 клеток, пока биолюминесцентные сигналы исчезают. Через 10 минут после ренилья люцифераза изображения, использовать инсулин шприц интраперитонально вводить соответствующий объем D-люциферина в каждое животное. Через 10 минут после инъекции D-люциферина поместите мышей в камеру камеры и получить несколько изображений спинной мыши, чтобы приобрести сигналы Светлячка люциферазы от ангиогенеза.
После трансдукции лентивируса более 99% клеток являются RFP-положительными без различий в морфологии клеточной культуры, наблюдаемой между двумя трансдуцированными клеточными линиями. Впоследствии биолюминесценция изображений транс индуцированных клеток показывает, что обе клеточные линии излучают сильные биолюминесцентные сигналы аналогичной силы. После подкожной инъекции трансдуцированных клеточных линий в трансгенную модель опухолевых мышей, ангиогенез-индуцированный рост опухоли может быть оценен сигналами Светлячка люциферазы в присутствии D-люциферина в том же животном.
В течение семи дней после имплантации администрация Ганцикловира вызывает смерть в клетках 4T1-RRT, что приводит к резкому снижению сигнала лусиферазы Рениллы в опухолях, установленных этими клетками. Сигналы светлячка люциферазы также увеличиваются в сочетании с увеличением экспрессии люциферазы Renilla и уменьшаются после снижения люциферазы. Взятые вместе, эти результаты показывают, что существует прямая корреляция между ангиогенезом опухоли и ростом опухоли.
Действительно, Ганцикловир индуцированной смерти опухолевых клеток может привести к ингибированию ангиогенеза опухоли. Кроме того, иммуностеинирование для антисосудистого эндотелиального фактора роста рецептора II, как маркер ангиогенеза, выявляет более значительно установленную микрососудистую структуру в секциях опухолевых тканей 4T1-RR, чем в секциях из опухолей 4T1-RRT, что согласуется со снижением сигнала Светлячка люциферазы, наблюдаемого после введения Ганцикловира. Наиболее важным шагом протокола является использование двух видов люциферазы, таких как FLuc и RLuc для одновременного отслеживания клеток и ангиогенеза.
Эта технология может быть использована для лечения раковых клеток в разных местах, и она может быть широко использована в моделях рака вируса. Эта модель мыши позволяет рост опухоли и противоопухолкового воздействия системы отслеживания HSV-ttk/GCV быть динамически визуализированы в живом животном. Для предотвращения трансфекции лентивируса требуется средство биобезопасности II уровня, поскольку средства массовой информации содержат частицы лентивируса, которые могут быть вредны для человека.
