Этот модульный протокол позволяет исследовать множественные молекулярные события, вызванные структурными и сигнальными липидами и/или РНК, в незаметных областях тканей и в крови с улучшенным количественным и качественным выводом данных на образец образца. Метод применим к любой экспериментальной модели, а также может быть применен к образцам тканей человека и крови. Продемонстрировать процедуру будут Клаудия Швиттер, техник, Джулия Пост, аспирантка, и Раиса Лернер, постдок в моей группе.
Для начала возьмем ранее изолированный, целый, замороженный мозг мышей с острой и профилактической эпилепсией, вызванной кайновой кислотой. Установите мозги на систему крепления криостата. Установите толщину на 50 микрометров и нарежьте мозг в режиме обрезки близко к интересующей области.
При приближении к интересующей области установите толщину от 18 до 20 микрометров. Чтобы локализовать интересующий субрегион, окрашивают срезы мозга с помощью толуидина синего цвета. Используйте микроскоп для осмотра окрашенных срезов, чтобы определить области, представляющие интерес для пробивки, и используйте атлас мыши в качестве ссылки, чтобы найти соответствующие анатомические области мозга.
Используйте пробоотборники для получения ударов диаметром от 0,8 до 1,0 миллиметра. Переведите перфораторы для коэкстракции эндоканнабиноидов и эйкозаноидов в предварительно охлажденные 2 миллилитровые янтарные трубки с семью предварительно охлажденными стальными шариками на трубку. Для коэкстракции фосфолипидов и эндоканнабиноидов, двойной липидной и РНК-коэкстракции переведите перфораторы в экстракционные трубки без РНКазы с керамическими шариками.
Взвесьте замороженные перфораторы в холодном помещении и сразу же приступайте к извлечению или заморозьте при температуре 80 градусов Цельсия. Чтобы выполнить жидкостно-жидкостную липидную коэкстракцию эндоканнабиноидов и эйкозаноидов из кусочков мозга, пуншей или образцов порошка тканей, поместите экстракционные трубки, содержащие образцы тканей и семь стальных шариков, на льду. Добавьте 600 микролитров ледяного МТБЭ и 50 микролитров ацетонитрильной воды, содержащей внутренние стандарты.
После добавления 400 микролитров 0,1 молярной муравьиной кислоты используйте тканевой лизер для гомогенизации в течение 30 секунд до 1 минуты. Центрифугируйте этот гомогенат в течение 15 минут при 5 000 г при 4 градусах Цельсия. Поместите его в морозильную камеру на 10 минут при температуре 80 градусов Цельсия, чтобы заморозить водную нижнюю фазу, что облегчит перенос верхней органической фазы.
Переведите верхнюю органическую фазу в новые 1,5-миллилитровые янтарные трубки, испарите под мягким потоком азота при 37 градусах Цельсия в течение 10 минут, а затем восстановите в 50 микролитрах ацетонитрильной воды для дальнейшего анализа. Храните водную фазу при температуре 20 или 80 градусов Цельсия для дальнейшего анализа содержания белка. Чтобы коэкстрактировать эндоканнабиноиды и эйкозаноиды из образцов плазмы, поместите замороженные образцы плазмы на лед и дайте им полностью оттаять.
Добавьте 800 микролитров МТБЭ и 50 микролитров ацетонитрильной воды, содержащей внутренние стандарты, оптимизированные для спайков с использованием образцов эталонной плазмы. Добавьте 600 микролитров 0,1 молярной муравьиной кислоты и вихрь при 4 градусах Цельсия в течение 2 минут. Центрифугируйте образцы по 4 000 г в течение 15 минут при 4 градусах Цельсия.
Перенесите органическую фазу в новые трубки. Испарите его под мягким потоком азота при 37 градусах Цельсия, а затем восстановите его 50 микролитрами ацетонитрильной воды для анализа множественного реакционного мониторинга жидкостной хроматографии. Чтобы выполнить коэкстракцию фосфолипидов и эндоканнабиноидов из областей мозга, ударов или других образцов порошка тканей, поместите экстракционные трубки, содержащие образцы тканей и керамические шарики, на лед.
Добавьте 800 микролитров смеси метилтрет-бутилового эфира и метанола и 10 микролитров метанола, содержащего внутренние стандарты. Затем добавляют 200 микролитров 0,1% муравьиной кислоты, содержащей 25 микромолярного тетрагидролипстатина/URB597 и 50 мкг на миллилитр BHT. После гомогенизации тканевым гомогенизатором центрифугируют при 5 000 г и 4 градусах Цельсия в течение 15 минут.
Перенесите верхнюю органическую фазу в новые трубки, испаритесь под мягким потоком азота при 37 градусах Цельсия, а затем восстановите этот липидный экстракт с 90 микролитрами метанола. Если все происходит немедленно, добавьте 10% воды к аликвоте липидного экстракта и введите 10 микролитров в LC / MS для анализа фосфолипидов. Для дальнейшего эндоканнабиноидного анализа перейдите к следующему шагу.
Возьмите аликвоту липидного экстракта, испарите до сухости и восстановите в ацетонитрильной воде. Выполнить двойную экстракцию РНК и липидов и коэкстракцию фосфолипидов и эндоканнабиноидов из образцов тканей, разморозить тканевые порошковые аликвоты или мозговые пучки при 4 градусах Цельсия. Добавьте ткань в экстракционные трубки керамическими шариками.
Затем добавляют 600 микролитров буфера RLT вместе с 200 микролитрами хлороформа. Для коэкстракции фосфолипидов и эндоканнабиноидов образцы шипов с 10 микролитрами внутренней стандартной смеси и гомогенизируются на высокой скорости в течение 20 секунд. Перенесите гомогенизированные образцы в новые центрифужные трубки и центрифугу в течение пяти минут на полной скорости и 4 градуса Цельсия, чтобы обеспечить разделение фаз.
Перенесите верхнюю фазу в свежую трубку для экстракции РНК с помощью стандартного набора. Элют экстрагирует РНК в общем объеме 50 микролитров рваной воды и хранит ее при 80 градусах Цельсия. Для экстракции липидов добавьте 800 микролитров МТБЭ/метанола и 200 микролитров 0,1% муравьиной кислоты в нижнюю хлороформсодержащую фазу.
Вихрь в течение 45 минут при 4 градусах Цельсия. Перенесите верхнюю органическую фазу в новую трубку. Испаряйте его под мягкой струей азота при 37 градусах Цельсия.
Для дальнейшего анализа LC/MS восстановите образец в 90 микролитрах метанола и храните его при температуре 20 или 80 градусов Цельсия или немедленно приступайте к анализу. Для дальнейшего эндоканнабиноидного анализа перейдите к следующему шагу. Возьмите аликвоту липидного экстракта, испарите до сухости и восстановите в ацетонитрильной воде.
Затем введите 20 микролитров в LC/MS для эндоканнабиноидного анализа. Индукция кайновой кислоты при острых эпилептических припадках приводила к максимальной интенсивности приступов через час после инъекции. Липидомное профилирование эндоканнабиноидов и эйкозаноидов, а также фосфолипидов и эндоканнабиноидов показывает изменения уровня липидов в коре головного мозга, полосатом теле, таламической области, гиппокампе, гипоталамусе, мозжечке, а также в сердце и легочной ткани у эпилептических мышей и контрольной группы, индуцированных кайновой кислотой.
После двойной экстракции фосфолипидов и эндоканнабиноидов и РНК для количественного профилирования ударов мозга мыши было проанализировано количественное распределение липидов в гипоталамусе, базолатеральной миндалине, вентральном и дорсальном гиппокампе. Относительные уровни экспрессии эндогенных ферментов и рецепторов, участвующих в липидной передаче сигналов, а также маркеры активности мозга, исследованные на уровне мРНК в различных областях мозга и субрегионах у мышей, подвергшихся эпилептическому припадку, индуцированному кайновой кислотой, и контрольной группе. Эпилепсия, вызванная кайновой кислотой, вызвала массивную потерю сигнала NeuN, преимущественно в области CA1, CA3 и хилуса гиппокампа, сопровождаемую апоптотическими событиями, указанными сигналом каспазы-3 по сравнению с контрольными мышами, введенными физиологическим раствором.
После лечения субхроническим пальмитоилэтаноламидом сигнал белка нейрональных ядер заметно сохранялся, а сигнал CASP3 едва обнаруживался. Мозговой удар и рассечение незаметных областей мозга довольно сложны и требуют прекрасных навыков для получения последовательной выборки в нескольких когортах. Поэтому практика на тестовых органах и хорошее знание морфологии мозга настоятельно рекомендуются.
