Эта процедура описывает сбор дискретных замороженных областей мозга для получения высококачественного белка и РНК с использованием недорогих и широко доступных инструментов. Поскольку области мозга заморожены от сбора урожая путем вскрытия, молекулы-мишени сохраняются, и исследователь у него есть время тщательно вскрыть и хранить области, представляющие интерес. Определение регионов, представляющих интерес, на начальном этапе может быть сложной задачей.
Использование общих ориентиров мозга, как они возникают и отступают через разделы по отношению к желаемым регионам сделает идентификацию ясно. После удаления мозгов из усыпанных взрослых мышей CD-1 дикого типа, вспышка заморозить ткани в течение 60 секунд либо жидкого азота или изопентана. Предварительно охладить с сухим льдом и хранить его при температуре минус 80 градусов по Цельсию.
За 24 часа до вскрытия ткани поместите чистую матрицу мозга на стопку разморожевания морозильных пакетов. И сэндвич стороны матрицы между двумя морозильными пакетами убедившись, что оставить примерно пол-сантиметра между нижней части бритвы слотов и верхней части пакетов. Установите замороженную стеклянную пластину для вскрытия, заполнив изолированную коробку со льдом до пяти сантиметров сверху.
Затем поместите 2,5-сантиметровый слой сухого льда сверху. И накройте его черной пластиковой пленкой. Поместите стеклянную тарелку поверх пластика.
И сухой лед вокруг границ плиты. Удалите замороженную матрицу мозга из морозильной камеры и вставьте мозг, кору вверх, в матрицу. Дайте ткани уравночные до температуры в коробке в течение 10 минут.
Сохраняя крышку открытой в течение этого времени. Используйте холодные типсы, чтобы настроить положение мозга в матрице так, чтобы сагиттаальный пазуха и поперечная пазуха выстраивались в линию перпендикулярных канавок блока. Как только мозг находится в положении, поместите охлажденное лезвие бритвы рядом с его центром и нажмите его примерно на один миллиметр в ткань.
Затем поместите одно охлажденное лезвие на каждом конце мозга и нажмите всю дорогу вниз в матрицу. Затем начните добавлять охлажденные лезвия на ростральном конце, помещая их в слоты по одному и осторожно прижимая их на один миллиметр в ткань. Продолжайте добавлять лезвия с интервалом в один миллиметр, работая в направлении хвостового конца.
Когда все лезвия на месте, нажмите сверху пальцами, ладонью или тупым предметом и качайте их медленно из стороны в сторону, чтобы переместить их через ткань. После того, как лезвия достигли нижней части слотов, схватить каждую сторону группы лезвий и освободить их от матрицы, качаясь вперед и назад. После освобождения группы лезвий поместите их ростральной стороной вверх на стеклянную пластину, и положить сухой лед рядом с или на вершине стека для дальнейшего замораживания образцов для облегчения разделения.
Затем поместите стек с острыми краями вниз и отделить лезвия, перемещая стек между большим и большим пальцами. Выстроить раздел на стеклянных пластинах от рострала до каудала и отделить ткань от лезвий, сгибая их между пальцами, или отделяя их вторым охлажденным лезвием. Временами, ткань может придерживаться обеих сторон лезвия и должны быть приняты меры по поддержанию ростральной каудальной ориентации.
Перед началом вскрытия откройте атлас мозга Аллена Мауса или другую ссылку и найдите ориентиры, необходимые для определения регионов, представляющих интерес. Используйте охлажденные типсы или лезвия, чтобы перевернуть раздел. И убедитесь, что регион интересов является последовательным во всем разделе.
Нарезать секцию чистым скальпелем или пуншом, аккуратно, но твердо в ткань. Rocking его вперед и назад, чтобы сделать разрез. После уборки области интереса, поместите его в помечены предварительно охлажденных 1,5 миллиметра труб и хранить их при температуре минус 80 градусов по Цельсию.
Для обработки ткани добавьте холодный буфер RIPA для извлечения белка или гуанидин, содержащий растворитель для экстракции РНК, и немедленно гомогенизируйте его стеклянными падениями или механическим гомогенизатором. Для проверки этого метода, медиальной префронтальной коры был собран из взрослых CD-1 диких мышей типа мужчин, и РНК и белок были охарактеризованы. При анализе с капиллярным электрофорезом, деградированная РНК показывает потерю интенсивности 28S и 18S рибосомных полос, а также мазок между 25 и 200 нуклеотидов.
В то время как высококачественная РНК показывает различные рибосомные полосы практически без сигнала в области более низкого молекулярного веса. РНК, получаемая с использованием замороженного метода вскрытия, сравнивалась с РНК, подготовленной из свежесобранной ткани. Оба метода производят РНК с высокими номерами целостности и сильной рибосомной полосой.
Чтобы подтвердить, что этот метод может быть использован для сохранения микроокниронности вскрытой ткани для более поздних анализов, РНК была извлечена из вскрытой медиальной префронтальной коры, которая хранилась в течение нескольких недель. Все образцы производили высококачественную РНК с различными рибосомной полосой и номерами целостности РНК выше восьми. Для подтверждения целостности белка замороженных вскрытых образцов, белок был собран, передан в нитроцеллюлозы и зонд с антителами против высокой молекулярной цели веса KCC2, и более низкий молекулярный вес белка актина.
Во всех случаях полосы были острыми и отчетливыми без заметных продуктов разбивки. Важно, чтобы ткани заморожены на протяжении всего процесса, поскольку это сохраняет микроокнижение секций и поддерживать морфологию раздела для сравнения с изображениями атласа мозга. Области интересов, собранные таким образом, могут храниться в течение нескольких месяцев при отрицательном 80 градусов по Цельсию и могут быть использованы во многих приложениях ниже по течению, включая RT-qPCR, РНК-Сек, западный анализ помарки и HPLC.
Этот метод был использован для изучения молекулярных изменений в лимбических системах перинатальных грызунов, подвергшихся воздействию ТГК и других каннабиноидов, чтобы лучше понять, как эти препараты могут повлиять на развитие мозга.
