Этот протокол предназначен для быстрой изоляции клеток от экранирующих интерфейсов для геномной характеристики, и эта возможность важна, поскольку она может сочетать макроскопически наблюдаемые особенности клеток с геномной информацией. Целевые бактериальные клетки из экранирующих интерфейсов могут быть изолированы с высоким пространственным положением операционно простым способом с использованием этого метода. Гидрогели могут быть реализованы в других интерфейсах скрининга.
Материал гидрогеля может быть легко включен в микрофлюидные каналы для извлечения по требованию клеток из микрофлюидных устройств. Начните с прививки буфера сшивки с желаемой плотностью клеток. Готовят раствор предшественника гидрогеля в 0,5-миллилитровой микроцентрифужной трубке, добавляя 12,5 микролитра сшивающего буфера и 5,6 микролитра раствора диакрилата ПЭГ ОНБ.
И, наконец, добавьте в смесь 6,9 микролитров раствора тиола ПЭГ для предплечья. Для инкапсуляции клеток в растворе предшественника гидрогеля поместите тиолированные основания на чистую чашку Петри и расположите две распорки на двух противоположных сторонах крышки. Закрепите распорки на крышке основания, приклеив распорки к чашке Петри.
После добавления желаемого объема раствора предшественника на нереакционноспособную перфторалкилированную стеклянную горку поместите затвор на основание крышки и дайте гидрогелевому образованию завершиться при комнатной температуре в течение 25 минут. Как только гелеобразование будет завершено, аккуратно удалите перфторалкилированный стеклянный слайд. Поместите субстрат в чашку Петри размером 60 на 15 миллиметров, содержащую среду ATGN, дополненную антибиотиком.
Посейте 700 микролитров бактериальных клеточных суспензий с OD 600 0,1 над субстратом микролуночного массива и получите раствор предшественника гидрогеля, как было продемонстрировано ранее, используя 12,5 микролитра фосфатного буферного физиологического раствора ATGN рН восемь. Пипетка 12,5 микролитров раствора-предшественника на нереакционноспособном перфторалкилированном стеклянном предметном стекле и размещение двух 38-микрометровых стальных распорок на двух противоположных сторонах подложки микролуночного массива, иннокулированной ячейками. Затем переверните перфторалкилированный стеклянный слайд с каплей раствора предшественника и поместите каплю в середину субстрата микролунки.
Когда гидрогель образуется после инкубации в течение 25 минут при комнатной температуре, осторожно удалите стеклянный слайд из микролунтового субстрата и поместите субстрат в чашку Петри, содержащую среду ATGN, дополненную антибиотиком. Поместите образец в держатель PDMS и добавьте определенную среду поверх образца, чтобы предотвратить обезвоживание образца и обеспечить раствор носителя для высвобождаемых клеток. После того, как калибровочное зеркало находится в положении, отрегулируйте фокус микроскопа, чтобы получить четкое изображение колоний в массиве гидрогелей или микролунок, и осмотрите, чтобы определить колонии или колодцы, представляющие интерес.
Здесь спроектируйте световые паттерны, в то время как вид камеры показывает колонии внутри образца, чтобы проверить различные паттерны для извлечения клеток и сохранить определенный шаблон. Затем выберите раздел управления сеансом, добавьте сохраненную последовательность на вкладку с названием инструмента узорчатой подсветки. Выберите опцию стимуляции узора для просмотра и настройки нужного места экспозиции.
Затем отрегулируйте интенсивность света до 60% и время экспозиции до 40 секунд под вкладкой управления светодиодами и запустите процесс экспозиции. Мониторинг деградации гидрогеля в режиме реального времени и режиме Brightfield для обеспечения высвобождения клеток. Чтобы собрать высвобожденную клетку, измените фильтр микроскопа с Brightfield на TRITC, чтобы визуализировать открытую область образца невооруженным глазом.
Как только открытая область будет найдена, поместите конец трубки на облученное место, а затем измените фильтр микроскопа обратно на Brightfield, чтобы контролировать извлечение клеток в режиме реального времени. Используйте шприц, прикрепленный к другому концу трубки, чтобы осторожно извлечь 200 микролитров раствора, содержащего освобожденные клетки, и перенести раствор в 1,5-миллиметровую центрифужную трубку для анализа ДНК или покрытия. Различные микроструктуры ультрафиолетового света использовались для извлечения клеток из объемных гидрогелей, что повлияло на морфологию высвобождаемых клеток.
Воздействие ультрафиолета в кольцевой схеме привело к высвобождению всей колонии, инкапсулированной в защитный гидрогель ПЭГ. Напротив, подвергая часть или всю колонию воздействию ультрафиолетового света, клетки могут быть извлечены либо как агрегированные кластеры клеток, либо как свободные отдельные клетки. Плотность посева клеток и толщина гидрогеля важны для инкапсуляции клеток.
Более тонкие гидрогели приводили к микроколониям с минимальным перекрытием колоний, в то время как гидрогели с увеличенной толщиной приводили к перекрытию колоний, что могло привести к извлечению нескольких колоний. Перекрывающиеся колонии могут вызвать перекрестное загрязнение во время экстракции из-за двумерного характера светового рисунка. Когда верхняя колония становилась мишенью, нижележащая колония также извлекалась вместе с ней.
Также оценивалось влияние различных микрообразов ультрафиолетового света на жизнеспособность клеток. Когда микроколонии подвергались воздействию контролируемых доз ультрафиолетового света в круговом или перекрестном виде, восстановление клеток и чистота ДНК не были затронуты. Клетки были успешно извлечены из массивов микролунок с использованием этого подхода, что было очевидно из репрезентативных изображений конфокальной микроскопии, где при облучении в круговом и кольцевом паттерне клетки удалялись в соответствующем рисунке.
После извлечения из массивов микровелл оценивали жизнеспособность клеток и количество ДНК. Паттерны воздействия не повлияли ни на количество жизнеспособных клеток, ни на качество ДНК, что указывает на то, что жизнеспособные клетки бактерий могут быть избирательно извлечены из микролунок с минимальным повреждением, а их ДНК может быть выделена с высокой чистотой для последующего геномного анализа. Всегда проверяйте, что гидрогель сформировался, прежде чем удалять перфторалкилированный покров.
Точность и осторожность необходимы для размещения распорок для гидрогелевого осаждения и использования трубок для экстракции клеток.
