이 프로토콜은 유전체 특성화를 위한 스크리닝 인터페이스에서 세포를 빠르게 격리하도록 설계되었으며, 이 기능은 거시적으로 관찰 가능한 셀 피처를 게놈 정보와 결합할 수 있기 때문에 중요합니다. 스크리닝 인터페이스에서 표적화된 세균 세포는 이 기술을 사용하여 작동적으로 간단한 방식으로 높은 공간 위치로 격리될 수 있다. 하이드로겔은 다른 스크리닝 인터페이스에서 구현될 수 있다.
하이드로겔 물질은 미세 유체 장치에서 세포의 온디맨드 검색을 위해 미세 유체 채널에 쉽게 통합될 수 있습니다. 먼저 교차 연결 버퍼를 원하는 셀 밀도로 접종합니다. 0.5 밀리리터 마이크로센심분리기 튜브에 하이드로겔 전구체 용액을 12.5 마이크로리터의 교차 연결 버퍼와 PEG ONB 디아크릴레이트 용액의 5.6 마이크로리터를 추가하여 준비한다.
그리고 마지막으로, 혼합물에 팔뚝 PEG 티올 용액의 6.9 마이크로 리터를 추가합니다. 하이드로겔 전구체 용액의 셀 캡슐화의 경우, 깨끗한 페트리 접시에 티오레이드 베이스 커버립을 놓고 커버슬립의 두 반대쪽에 두 개의 스페이서를 배치합니다. 스페이서를 페트리 접시에 테이핑하여 베이스 커버슬립의 스페이서를 수정합니다.
비반응성 역류 유리 슬라이드에 전구체 용액의 원하는 부피를 추가한 후, 슬라이드를 베이스 커버슬립에 놓고 25분 동안 실온에서 하이드로겔 형성을 완료할 수 있도록 한다. 겔화가 완료되면, 부드럽게 퍼플루오로알키드 유리 슬라이드를 제거합니다. 항생제로 보충 된 ATGN 미디어를 포함하는 60 by 15 밀리미터 페트리 접시에 기판을 놓습니다.
종자 700 마이크로리터는 마이크로웰 어레이 기판에 대해 0.1의 OD 600을 가진 세균세포 현탁액을 제거하고 pH 8의 인산염 완충식식염염의 12.5 마이크로리터를 사용하여 이전에 입증된 바와 같이 하이드로겔 전구체 용액을 만든다. 비반응성 역류 유리 슬라이드에 전구체 용액의 파이펫 12.5 마이크로리터와 세포로 접종된 마이크로웰 어레이 기판의 두 개의 반대쪽에 38 마이크로미터 강철 스페이서 2개를 배치한다. 그런 다음 전구체 용액 액을 가진 역류 유리 슬라이드를 반전시키고 마이크로웰 기판 의 중간에 액적을 놓습니다.
하이드로겔이 실온에서 25분의 배양 후 형성되면, 마이크로웰 기판에서 유리 슬라이드를 부드럽게 제거하고 항생제로 보충된 ATGN 매체를 함유한 페트리 접시에 기판을 놓는다. 샘플을 PDMS 홀더에 넣고 시료 탈수를 방지하고 방출된 셀에 대한 반송파 솔루션을 제공하기 위해 정의된 미디어를 샘플 위에 추가합니다. 교정 거울을 위치에 가져온 후 현미경 초점을 조정하여 하이드로겔 또는 마이크로웰 어레이 내의 콜로니의 선명한 이미지를 얻고 콜로니 또는 관심 있는 우물을 식별하도록 검사합니다.
여기서, 카메라 뷰가 샘플 내부의 콜로니를 보여주면서 조명 패턴을 설계하여 셀 추출을 위한 상이한 패턴을 테스트하고 정의된 패턴을 저장합니다. 그런 다음 세션 제어 섹션을 선택하고 패턴 조명 도구 제품 이름으로 제목의 탭 아래에 저장된 시퀀스를 추가합니다. 원하는 노출 위치를 보고 조정할 수 있는 패턴을 자극하는 옵션을 선택합니다.
다음으로, 광 강도를 60%로 조정하고 노출 시간을 LED 제어 탭 에서 40초로 조정하고 노출 프로세스를 시작합니다. 하이드로겔 분해를 실시간으로 모니터링하고 브라이트필드 모드를 사용하여 셀 방출을 보장합니다. 방출된 세포를 수집하기 위하여는, 현미경 필터를 브라이트필드에서 TRITC로 변경하여 육안으로 시료의 노출된 영역을 시각화합니다.
노출 된 영역이 있으면, 조사 된 지점에 튜브의 끝을 배치 한 다음 현미경 필터를 브라이트 필드로 다시 변경하여 실시간으로 세포 검색을 모니터링합니다. 튜브의 다른 쪽 끝에 부착 된 주사기를 사용하여 방출 된 세포를 포함하는 용액 200 마이크로 리터를 조심스럽게 철회하고 DNA 분석 또는 도금을 위한 1.5 mm 원심 분리 튜브로 용액을 전송하십시오. 다른 UV 광 마이크로 패턴은 방출 된 세포의 형태에 영향을 미치는 벌크 하이드로 겔에서 세포 추출에 사용되었다.
링 패턴의 UV 노출은 보호 PEG 하이드로겔에 캡슐화된 전체 식민지의 방출을 초래했습니다. 대조적으로, 식민지의 일부 또는 전부를 UV 광에 노출시킴으로써, 세포는 집계된 세포 클러스터또는 자유로운 개별 세포로 추출될 수 있었습니다. 하이드로겔의 세포 시싱 밀도 및 두께는 세포 캡슐화에 중요합니다.
얇은 하이드로겔은 최소한의 식민지 중복으로 마이크로 콜로니를 초래했으며, 두께가 증가한 하이드로겔은 겹치는 식민지를 초래하여 여러 식민지를 추출할 수 있습니다. 중첩된 콜로니는 빛 패턴의 2차원 특성으로 인해 추출 하는 동안 교차 오염을 일으킬 수 있습니다. 상부 식민지가 표적으로 삼았을 때, 기본 식민지도 그것으로 추출되었습니다.
세포 생존가능성에 대한 다양한 자외선 마이크로 패턴의 효과도 평가되었다. 마이크로 콜로니가 원형 또는 교차 패턴에서 UV 광의 통제 된 복용량에 노출되었을 때, 세포 복구 및 DNA 순도는 영향을받지 않았다. 세포는 이 접근법을 사용하여 마이크로웰 어레이로부터 성공적으로 회수되었으며, 이는 대표적인 공초점 현미경 이미지에서 분명하게 드러났으며, 원형 및 링 패턴에서 조사할 때 세포는 각각의 패턴으로 제거되었다.
마이크로웰 어레이에서 추출한 후 세포 생존가능성과 DNA 양을 평가했습니다. 노출 패턴은 실행 가능한 세포 수도 또는 DNA 질에 영향을 미치지 않으며, 실행 가능한 박테리아 세포가 최소한의 손상으로 마이크로웰에서 선택적으로 검색될 수 있고, 그들의 DNA는 다운스트림 게놈 분석을 위한 고순도에서 격리될 수 있었다는 것을 표시합니다. 항상 수압겔이 퍼플루오로알키드 커버슬립을 제거하기 전에 형성되었는지 확인하십시오.
하이드로겔 증착을 위해 스페이서를 배치하고 세포 추출을 위해 튜브를 사용하는 데는 정밀도와 주의가 필요합니다.
