Bu protokol, hücreleri genomik karakterizasyon için tarama arayüzlerinden hızla izole etmek için tasarlanmıştır ve bu yetenek, makroskopik olarak gözlemlenebilir hücre özelliklerini genomik bilgilerle birleştirebildiği için önemlidir. Tarama arayüzlerinden hedeflenen bakteri hücreleri, bu teknik kullanılarak operasyonel olarak basit bir şekilde yüksek uzamsal konumla izole edilebilir. Hidrojeller diğer tarama arayüzlerinde uygulanabilir.
Hidrojel malzeme, hücrelerin mikroakışkan cihazlardan isteğe bağlı olarak alınması için mikroakışkan kanallara kolayca dahil edilebilir. Çapraz bağlama tamponu istenen hücre yoğunluğu ile aşılayarak başlayın. Çapraz bağlama tamponunun 12,5 mikrolitresini ve PEG ONB diakrilit çözeltisinin 5,6 mikrolitresini ekleyerek hidrojel öncül çözeltisini 0,5 mililitrelik bir mikrosantrifüj tüpünde hazırlayın.
Ve son olarak, karışıma 6.9 mikrolitrelik forearm PEG tiyol çözeltisi ekleyin. Hidrojel öncül çözeltisinde hücre kapsülleme için, tiyolated baz kapakları temiz bir Petri kabına yerleştirin ve kapakçık iki karşı tarafına iki aralayıcı yerleştirin. Aralayıcıları Petri kabına bantlayarak taban kapak kapağındaki araları sabitlayın.
Reaktif olmayan perfloroalkylated cam kaydırağına öncü çözeltinin istenen hacmini ekledikten sonra, slaydı taban kapak kapağına yerleştirin ve hidrojel oluşumunun oda sıcaklığında 25 dakika boyunca tamamlanmasını bekleyin. Jelleşme tamamlandıktan sonra, perfloroalkylated cam slaydı yavaşça çıkarın. Substratı antibiyotikle desteklenmiş ATGN ortamı içeren 60 ila 15 milimetre Petri kabına yerleştirin.
Mikrowell dizisi substratı üzerinde 0.1 OD 600 ile bakteri hücresi süspansiyonlarının tohum 700 mikrolitresi ve daha önce gösterildiği gibi hidrojel öncül çözeltisini pH sekiz fosfat tamponlu salin ATGN 12.5 mikrolitre kullanarak yapmak. Pipet 12.5 reaktif olmayan perfloroalkylated cam slayt üzerinde öncü çözeltinin mikrolitreleri ve hücreler ile aşılanmış mikrowell dizisi substratının iki karşı tarafına iki adet 38 mikrometre çelik ara parça yerleştirin. Daha sonra perfloroalkylated cam kaydırağı öncü çözelti damlacığı ile ters çevirin ve mikrowell substratının ortasına bir damlacık yerleştirin.
Hidrojel oda sıcaklığında 25 dakikalık bir inkübasyondan sonra oluştuğunda, cam slaydı mikrowell substratından hafifçe çıkarın ve substratı antibiyotikle desteklenmiş ATGN ortamı içeren bir Petri kabına yerleştirin. Örneği bir PDMS tutucusuna yerleştirin ve numune dehidrasyonunu önlemek ve serbest bırakılan hücreler için bir taşıyıcı çözüm sağlamak için tanımlanan ortamı numunenin üzerine ekleyin. Kalibrasyon aynasını yerine getirdikten sonra, hidrojel veya microwell dizisindeki kolonilerin keskin bir görüntüsünü elde etmek için mikroskop odağını ayarlayın ve kolonileri veya ilgi çekici kuyuları tanımlamak için inceleyin.
Burada, kamera görünümü hücre çıkarma için farklı desenleri test etmek ve tanımlanan deseni kaydetmek için numunenin içindeki kolonileri gösterirken ışık desenlerini tasarlayın. Ardından oturum denetimi bölümünü seçin, desenli aydınlatma aracı ürün adıyla başlıklı sekmenin altına kaydedilmiş sırayı ekleyin. İstediğiniz pozlama konumunu görüntülemek ve ayarlamak için deseni uyarma seçeneğini belirleyin.
Ardından, LED kontrol sekmesi altında ışık yoğunluğunu %60'a ve pozlama süresini 40 saniyeye ayarlayın ve pozlama işlemini başlatın. Hücre salınımını sağlamak için hidrojel bozulmasını gerçek zamanlı ve Brightfield modunda izleyin. Serbest bırakılan hücreyi toplamak için mikroskop filtresini Brightfield'dan TRITC'ye değiştirerek numunenin açıkta kalan alanını çıplak gözle görselleştirin.
Açık alan yerleştirildikten sonra, borunun ucunu ışınlanmış noktaya yerleştirin, ardından hücre alımını gerçek zamanlı olarak izlemek için mikroskop filtresini tekrar Brightfield olarak değiştirin. Serbest bırakılan hücreleri içeren 200 mikrolitre çözeltiyi dikkatlice çekmek ve çözeltiyi DNA analizi veya kaplama için 1,5 milimetrelik bir santrifüj tüpüne aktarmak için borunun diğer ucuna bağlı şırıngayı kullanın. Serbest bırakılan hücrelerin morfolojisini etkileyen dökme hidrojellerden hücre ekstraksiyonu için farklı UV ışık mikro desenleri kullanılmıştır.
Halka deseninde UV maruziyeti, koruyucu bir PEG hidrojelinde kapsüllenmiş tüm koloninin serbest bırakılmasına neden oldu. Buna karşılık, koloninin bir kısmını veya tamamını UV ışığına maruz kalarak, hücreler agrega hücre kümeleri veya serbest bireysel hücreler olarak çıkarılabilir. Hücre tohumlama yoğunluğu ve hidrojel kalınlığı hücre kapsülleme için önemlidir.
Daha ince hidrojeller, minimum koloni üst üste binen mikro kolonilerle sonuçlanırken, artan kalınlıktaki hidrojeller üst üste binen kolonilerle sonuçlandı ve bu da birden fazla koloninin çıkarılmasına neden olabilir. Üst üste binen koloniler, ışık deseninin iki boyutlu doğası nedeniyle ekstraksiyon sırasında çapraz kontaminasyona neden olabilir. Üst koloni hedeflendiğinde, alttaki koloni de onunla birlikte çıkarıldı.
Çeşitli UV ışık mikro desenlerinin hücre canlılığı üzerindeki etkisi de değerlendirildi. Mikro koloniler dairesel veya çapraz desende kontrollü dozlarda UV ışığına maruz kaldıklarında hücre iyileşmesi ve DNA saflığı etkilenmedi. Hücreler, dairesel ve halka deseninde ışınlama yapıldıktan sonra hücrelerin ilgili desende çıkarıldığı temsili konfokal mikroskopi görüntülerinden belirgin olan bu yaklaşım kullanılarak microwell dizilerinden başarıyla alınmıştır.
Mikrowell dizilerinden çıkarıldıktan sonra hücre canlılığı ve DNA miktarı değerlendirildi. Maruz kalma şekilleri ne canlı hücre sayısını ne de DNA kalitesini etkiledi, bu da uygulanabilir bakteri hücrelerinin mikroüllerden en az hasarla seçici olarak alınabileceğini ve DNA'larının aşağı akış genomik analizi için yüksek saflıkta izole edilebileceğini gösterdi. Perfloroalkylated kapak sapını çıkarmadan önce her zaman hidrojel oluştuğunu kontrol edin.
Hidrojel biriktirme için ara maddeleri yerleştirmek ve hücrelerin çıkarılması için boruları kullanmak için hassasiyet ve bakım gereklidir.
