Este protocolo foi projetado para isolar rapidamente as células das interfaces de triagem para caracterização genômica e essa capacidade é significativa porque pode combinar recursos de células macroscopicamente observáveis com informações genômicas. As células bacterianas direcionadas das interfaces de triagem podem ser isoladas com alta posição espacial de forma operacionalmente simples usando essa técnica. Os hidrogéis podem ser implementados em outras interfaces de triagem.
O material de hidrogel pode ser facilmente incorporado em canais microfluidos para recuperação sob demanda de células de dispositivos microfluidos. Comece inoculando o tampão de ligação cruzada com a densidade celular desejada. Prepare a solução precursora do hidrogel em um tubo de microcentrífuga de 0,5 mililitro adicionando 12,5 microliters do buffer de ligação cruzada e 5,6 microlitradores da solução de diacrilato PEG ONB.
E por último, adicione 6,9 microliters de solução de tiool PEG do antebraço à mistura. Para encapsulamento celular na solução precursora do hidrogel, coloque as tampas de base tialada em uma placa de Petri limpa e posicione dois espaçadores nos dois lados opostos do deslizamento de cobertura. Fixar os espaçadores na tampa da base, gravando os espaçadores na placa de Petri.
Depois de adicionar o volume desejado da solução precursora em um slide de vidro perfluoroalquilado não reativo, coloque o slide na tampa da base e permita que a formação de hidrogel seja concluída à temperatura ambiente por 25 minutos. Uma vez que a gelação esteja completa, remova suavemente o deslizamento de vidro perfluoroalquilado. Coloque o substrato na placa de Petri de 60 por 15 milímetros contendo mídia ATGN complementada com antibiótico.
Semente 700 microliters de suspensões de células bacterianas com OD 600 de 0,1 sobre o substrato da matriz de microwell e fazer a solução precursora de hidrogel, como demonstrado anteriormente usando 12,5 microlitres de salina tamponada de fosfato ATGN de pH oito. Pipetas 12,5 microlitros da solução precursora em um deslizamento de vidro perfluoroalquilado não reativo e colocam dois espaçadores de aço de 38 micrômetros em dois lados opostos do substrato de matriz de micropovas innoculados com células. Em seguida, inverta o deslizamento de vidro perfluoroalquilado com a gota de solução precursora e coloque uma gotícula no meio do substrato de microwell.
Quando o hidrogel for formado após uma incubação de 25 minutos à temperatura ambiente, remova suavemente o slide de vidro do substrato de microwell e coloque o substrato em uma placa de Petri contendo mídia ATGN suplementada com antibiótico. Coloque a amostra em um suporte de PDMS e adicione a mídia definida no topo da amostra para evitar a desidratação da amostra e forneça uma solução portadora para células liberadas. Depois de colocar o espelho de calibração em posição, ajuste o foco do microscópio para obter uma imagem nítida das colônias dentro do conjunto de hidrogel ou microwell e inspecione para identificar colônias ou poços de interesse.
Aqui, projete os padrões de luz enquanto a visão da câmera mostra as colônias dentro da amostra para testar diferentes padrões para extração celular e salvar o padrão definido. Em seguida, selecione a seção de controle de sessão, adicione a sequência salva sob a guia intitulada com o nome do produto da ferramenta de iluminação padronizada. Escolha a opção para estimular o padrão para visualizar e ajustar o local de exposição desejado.
Em seguida, ajuste a intensidade da luz para 60% e o tempo de exposição para 40 segundos sob a guia de controle led e inicie o processo de exposição. Monitore a degradação do hidrogel em tempo real e o modo Brightfield para garantir a liberação da célula. Para coletar a célula liberada, altere o filtro de microscópio de Brightfield para TRITC para visualizar a área exposta da amostra a olho nu.
Uma vez localizada a área exposta, coloque a extremidade da tubulação sobre o local irradiado e, em seguida, mude o filtro de microscópio de volta para Brightfield para monitorar a recuperação celular em tempo real. Use a seringa presa à outra extremidade da tubulação para retirar cuidadosamente 200 microliters de solução contendo as células liberadas e transferir a solução para um tubo de centrífugas de 1,5 milímetros para análise ou revestimento de DNA. Diferentes micro padrões de luz UV foram usados para extração celular a partir de hidrogéis a granel, o que influenciou a morfologia das células liberadas.
A exposição uv em um padrão de anel resultou na liberação de toda a colônia encapsulada em um hidrogel PEG protetor. Em contraste, expondo parte ou toda a colônia à luz UV, as células poderiam ser extraídas tanto como aglomerados celulares agregados ou como células individuais livres. A densidade de semeadura celular e a espessura do hidrogel são importantes para o encapsulamento celular.
Os hidrogéis mais finos resultaram em micro colônias com sobreposição mínima de colônias, enquanto os hidrogéis com maior espessura resultaram em colônias sobrepostas, o que pode resultar na extração de múltiplas colônias. Colônias sobrepostas podem causar contaminação cruzada durante a extração devido à natureza bidimensional do padrão de luz. Quando uma colônia superior foi alvo, a colônia subjacente também foi extraída com ela.
Também foi avaliado o efeito de variados micro padrões de luz UV sobre a viabilidade celular. Quando as micro colônias foram expostas a doses controladas de luz UV em um padrão circular ou transversal, a recuperação celular e a pureza do DNA não foram afetadas. As células foram recuperadas com sucesso de matrizes de microwell usando essa abordagem, o que ficou evidente a partir das imagens representativas de microscopia confocal, onde após a irradiação no padrão circular e anel, as células foram removidas no respectivo padrão.
Após a extração de matrizes de microwell, a viabilidade celular e a quantidade de DNA foram avaliadas. Os padrões de exposição não afetaram nem a contagem de células viáveis nem a qualidade do DNA, indicando que as células viáveis das bactérias poderiam ser seletivamente recuperadas de microwells com dano mínimo, e seu DNA poderia ser isolado em alta pureza para análise genômica a jusante. Verifique sempre se o hidrogel se formou antes de remover o deslizamento de cobertura perfluoroalquilado.
Precisão e cuidado são necessários para colocar os espaçadores para deposição de hidrogel e usar os tubos para extração de células.
