Este protocolo está diseñado para aislar rápidamente las células de las interfaces de detección para la caracterización genómica y esta capacidad es significativa porque puede combinar características celulares observables macroscópicamente con información genómica. Las células bacterianas objetivo de las interfaces de detección se pueden aislar con una posición espacial alta de una manera operativamente simple utilizando esta técnica. Los hidrogeles se pueden implementar en otras interfaces de cribado.
El material de hidrogel se puede incorporar fácilmente en canales microfluídicos para la recuperación bajo demanda de células de dispositivos microfluídicos. Comience inoculando el búfer de reticulación con la densidad celular deseada. Prepare la solución precursora de hidrogel en un tubo de microcentrífuga de 0,5 mililitros agregando 12,5 microlitros del tampón de reticulación y 5,6 microlitros de solución de diacrilato PEG ONB.
Y por último, agregue 6.9 microlitros de solución de tiol PEG del antebrazo a la mezcla. Para la encapsulación celular en la solución precursora de hidrogel, coloque las cubiertas de la base tiolada en una placa de Petri limpia y coloque dos espaciadores en los dos lados opuestos de la cubierta. Fije los espaciadores en la cubierta de la base pegando los espaciadores a la placa de Petri.
Después de agregar el volumen deseado de la solución precursora en un portaobjetos de vidrio perfluoroalquilado no reactivo, coloque el portaobjetos en la cubierta base y permita que la formación de hidrogel se complete a temperatura ambiente durante 25 minutos. Una vez completada la gelificación, retire suavemente el portaobjetos de vidrio perfluoroalquilado. Coloque el sustrato en la placa de Petri de 60 por 15 milímetros que contiene medios ATGN suplementados con antibiótico.
Sembra 700 microlitros de suspensiones de células bacterianas con OD 600 de 0.1 sobre el sustrato de la matriz de micropocillos y hacer la solución precursora de hidrogel como se demostró anteriormente utilizando 12.5 microlitros de ATGN salino tamponado con fosfato de pH ocho. Pipetee 12,5 microlitros de la solución precursora en un portaobjetos de vidrio perfluoroalquilado no reactivo y coloque dos espaciadores de acero de 38 micrómetros en dos lados opuestos del sustrato de matriz de micropocillos inoculado con células. Luego invierta el portaobjetos de vidrio perfluoroalquilado con la gota de solución precursora y coloque una gota en el medio del sustrato del micropocillo.
Cuando se forme el hidrogel después de una incubación de 25 minutos a temperatura ambiente, retire suavemente el portaobjetos de vidrio del sustrato del micropocillo y coloque el sustrato en una placa de Petri que contenga medios ATGN suplementados con antibiótico. Coloque la muestra en un soporte PDMS y agregue el medio definido encima de la muestra para evitar la deshidratación de la muestra y proporcionar una solución portadora para las células liberadas. Después de colocar el espejo de calibración en su posición, ajuste el enfoque del microscopio para obtener una imagen nítida de las colonias dentro del hidrogel o la matriz de micropocillos e inspeccione para identificar colonias o pozos de interés.
Aquí, diseñe los patrones de luz mientras la vista de la cámara muestra las colonias dentro de la muestra para probar diferentes patrones para la extracción de células y guardar el patrón definido. Luego seleccione la sección de control de sesión, agregue la secuencia guardada debajo de la pestaña titulada con el nombre del producto de la herramienta de iluminación con patrones. Elija la opción para estimular el patrón para ver y ajustar la ubicación de exposición deseada.
A continuación, ajuste la intensidad de la luz al 60% y el tiempo de exposición a 40 segundos en la pestaña de control LED e inicie el proceso de exposición. Monitoree la degradación del hidrogel en tiempo real y el modo Brightfield para garantizar la liberación de la célula. Para recolectar la célula liberada, cambie el filtro del microscopio de Brightfield a TRITC para visualizar el área expuesta de la muestra a simple vista.
Una vez que se encuentre el área expuesta, coloque el extremo del tubo sobre el punto irradiado, luego cambie el filtro del microscopio a Brightfield para monitorear la recuperación de células en tiempo real. Use la jeringa conectada al otro extremo del tubo para extraer cuidadosamente 200 microlitros de solución que contienen las células liberadas y transferir la solución a un tubo centrífugo de 1,5 milímetros para el análisis o recubrimiento de ADN. Se utilizaron diferentes micro patrones de luz UV para la extracción celular de hidrogeles a granel, lo que influyó en la morfología de las células liberadas.
La exposición a los rayos UV en un patrón de anillo resultó en la liberación de toda la colonia encapsulada en un hidrogel PEG protector. Por el contrario, al exponer parte o la totalidad de la colonia a la luz UV, las células podrían extraerse como grupos de células agregadas o como células individuales libres. La densidad de siembra celular y el grosor del hidrogel son importantes para la encapsulación celular.
Los hidrogeles más delgados dieron lugar a micro colonias con una superposición mínima de colonias, mientras que los hidrogeles con mayor espesor dieron lugar a colonias superpuestas, lo que podría resultar en la extracción de múltiples colonias. Las colonias superpuestas pueden causar contaminación cruzada durante la extracción debido a la naturaleza bidimensional del patrón de luz. Cuando una colonia superior fue atacada, la colonia subyacente también fue extraída con ella.
También se evaluó el efecto de los micropatrones de luz UV variados sobre la viabilidad celular. Cuando las microcolonias fueron expuestas a dosis controladas de luz UV en un patrón circular o cruzado, la recuperación celular y la pureza del ADN no se vieron afectadas. Las células se recuperaron con éxito de matrices de micropocillos utilizando este enfoque, lo que fue evidente a partir de las imágenes representativas de microscopía confocal, donde tras la irradiación en el patrón circular y de anillo, las células se eliminaron en el patrón respectivo.
Después de la extracción de matrices de micropocillos, se evaluó la viabilidad celular y la cantidad de ADN. Los patrones de exposición no afectaron ni al recuento de células viables ni a la calidad del ADN, lo que indica que las células bacterianas viables podrían recuperarse selectivamente de micropocillos con un daño mínimo, y su ADN podría aislarse a alta pureza para el análisis genómico posterior. Compruebe siempre que el hidrogel se ha formado antes de retirar la funda perfluoroalquilada.
Se requiere precisión y cuidado para colocar los espaciadores para la deposición de hidrogel y usar los tubos para la extracción de células.
