تم تصميم هذا البروتوكول لعزل الخلايا بسرعة من واجهات الفحص لتوصيف الجينوم وهذه القدرة كبيرة لأنها يمكن أن تجمع بين ميزات الخلايا التي يمكن ملاحظتها بشكل كبير مع المعلومات الجينومية. يمكن عزل الخلايا البكتيرية المستهدفة من واجهات الفحص مع وضع مكاني عال بطريقة بسيطة من الناحية التشغيلية باستخدام هذه التقنية. ويمكن تنفيذ الهيدروجيلات في واجهات الفحص الأخرى.
ويمكن دمج مادة الهيدروجيل بسهولة في قنوات microfluidic لاسترجاع الخلايا عند الطلب من الأجهزة الدقيقة. ابدأ بتطعيم المخزن المؤقت للربط المتداخل بكثافة الخلية المطلوبة. إعداد حل السلائف هيدروجيل في أنبوب 0.5 ملليلتر من الطرد المركزي الدقيق عن طريق إضافة 12.5 ميكرولتر من العازلة عبر ربط و 5.6 ميكرولتر من محلول DIACRYLATE PEG ONB.
وأخيرا، إضافة 6.9 ميكرولتر من الساعد PEG ثيول الحل إلى الخليط. لتغليف الخلية في محلول السلائف هيدروجيل، ضع الأغطية قاعدة ثيولايد على طبق بيتري نظيفة ووضع اثنين من الفواصل على الجانبين المتعارضين من coverslip. إصلاح الفواصل على coverlip قاعدة عن طريق تسجيل الفواصل إلى طبق بيتري.
بعد إضافة الحجم المطلوب من محلول السلائف على شريحة زجاجية بيرفلوروالكيلاتيد غير تفاعلية ، ضع الشريحة على غطاء القاعدة واترك تشكيل الهيدروجيل يكتمل في درجة حرارة الغرفة لمدة 25 دقيقة. بمجرد اكتمال الهلام ، قم بإزالة الشريحة الزجاجية البيرفلوروالكيلات بلطف. ضع الركيزة في طبق بيتري 60 في 15 ملليمتر الذي يحتوي على وسائط ATGN تكملها المضادات الحيوية.
البذور 700 ميكرولتر من تعليق الخلايا البكتيرية مع OD 600 من 0.1 على ركيزة صفيف microwell وجعل محلول السلائف هيدروجيل كما هو موضح سابقا باستخدام 12.5 ميكرولتر من الفوسفات المخزنة ATGN المالحة من درجة الحموضة ثمانية. ماصة 12.5 ميكرولتر من محلول السلائف على شريحة زجاجية غير تفاعلية perfluoroalkylated ووضع اثنين من الفواصل الصلب 38 ميكرومتر على الجانبين المتعارضين من الركيزة صفيف microwell تلقيح مع الخلايا. ثم عكس الشريحة الزجاجية perfluoroalkylated مع قطرة حل السلائف ووضع قطرة في منتصف الركيزة microwell.
عندما يتم تشكيل الهيدروجيل بعد حضانة لمدة 25 دقيقة في درجة حرارة الغرفة، قم بإزالة الشريحة الزجاجية برفق من ركيزة microwell ووضع الركيزة في طبق بيتري يحتوي على وسائط ATGN تكملها المضادات الحيوية. ضع العينة في حامل PDMS وأضف الوسائط المحددة أعلى العينة لمنع جفاف العينة وتوفير حل الناقل للخلايا الصادرة. بعد إحضار مرآة المعايرة في موضعها، قم بضبط تركيز المجهر للحصول على صورة حادة للمستعمرات داخل صفيف الهيدروجيل أو ميكروويل وتفقد لتحديد المستعمرات أو الآبار ذات الاهتمام.
هنا، قم بتصميم أنماط الضوء بينما تظهر طريقة عرض الكاميرا المستعمرات داخل العينة لاختبار أنماط مختلفة لاستخراج الخلايا وحفظ النمط المحدد. ثم حدد قسم التحكم في الجلسة، ثم أضف التسلسل المحفوظ أسفل علامة التبويب التي تحمل اسم منتج أداة الإضاءة المنقوشة. اختر الخيار لتحفيز النمط لعرض موقع التعرض المطلوب وضبطه.
بعد ذلك، قم بضبط شدة الضوء إلى 60٪ ووقت التعرض إلى 40 ثانية تحت علامة التبويب التحكم LED وابدأ عملية التعريض الضوئي. رصد تدهور هيدروجيل في الوقت الحقيقي ووضع برايتفيلد لضمان الإفراج عن الخلية. لجمع الخلية الصادرة، قم بتغيير فلتر المجهر من برايتفيلد إلى TRITC لتصور المنطقة المكشوفة للعينة بالعين المجردة.
بمجرد أن تقع المنطقة المكشوفة ، ضع نهاية الأنبوب على البقعة المشععة ، ثم قم بتغيير فلتر المجهر مرة أخرى إلى Brightfield لمراقبة استرجاع الخلايا في الوقت الفعلي. استخدم المحاقن المرفقة بالطرف الآخر من الأنبوب لسحب 200 ميكرولتر من المحلول الذي يحتوي على الخلايا المفرج عنها بعناية ونقل المحلول إلى أنبوب طرد مركزي عيار 1.5 ملليمتر لتحليل الحمض النووي أو الطلاء. تم استخدام أنماط مختلفة من الأشعة فوق البنفسجية الدقيقة لاستخراج الخلايا من الهيدروجيلات السائبة ، مما أثر على مورفولوجيا الخلايا الصادرة.
أدى التعرض للأشعة فوق البنفسجية في نمط حلقة في الإفراج عن مستعمرة كاملة مغلفة في هيدروجيل PEG واقية. في المقابل، من خلال تعريض جزء أو كل المستعمرة للأشعة فوق البنفسجية، يمكن استخراج الخلايا إما كتجمعات خلايا مجمعة أو كخلايا فردية حرة. كثافة بذر الخلية وسماكة الهيدروجيل مهمة لتغليف الخلية.
أدت الهيدروجيلات الأرق إلى مستعمرات صغيرة مع الحد الأدنى من تداخل المستعمرة ، في حين أن الهيدروجيلات ذات السمك المتزايد أدت إلى تداخل المستعمرات ، مما قد يؤدي إلى استخراج مستعمرات متعددة. يمكن أن يسبب تداخل المستعمرات تلوثا متقاطعا أثناء الاستخراج بسبب الطبيعة ثنائية الأبعاد لنمط الضوء. عندما تم استهداف مستعمرة كبيرة، تم استخراج المستعمرة الأساسية أيضا معها.
كما تم تقييم تأثير الأنماط الدقيقة المتنوعة للأشعة فوق البنفسجية على صلاحية الخلية. عندما تعرضت المستعمرات الدقيقة لجرعات خاضعة للرقابة من ضوء الأشعة فوق البنفسجية في نمط دائري أو عبر، لم يتأثر استعادة الخلايا ونقاء الحمض النووي. تم استرجاع الخلايا بنجاح من صفائف microwell باستخدام هذا النهج ، وهو ما كان واضحا من صور المجهر الكونفوجكال التمثيلية ، حيث عند التشعيع في النمط الدائري والحلقي ، تمت إزالة الخلايا في النمط المعني.
بعد الاستخراج من صفائف microwell ، تم تقييم صلاحية الخلية وكمية الحمض النووي. ولم تؤثر أنماط التعرض على عدد الخلايا القابلة للتطبيق ولا على جودة الحمض النووي، مما يشير إلى أنه يمكن استرجاع خلايا البكتيريا القابلة للحياة بشكل انتقائي من الخلايا الدقيقة بأقل قدر من الضرر، ويمكن عزل حمضها النووي بنقاء عال لتحليل الجينوم في المصب. تحقق دائما من أن الهيدروجيل قد تشكل قبل إزالة غطاء البيرفلوروالكيلاتيد.
مطلوب الدقة والرعاية لوضع الفواصل لترسب الهيدروجيل واستخدام الأنابيب لاستخراج الخلايا.
