Пептиды РАН являются особенностью рецидива нейродегенеративных расстройств, таких как болезнь Хантингтона, боковой амиотрофический склероз и фронтотемпоральная деменция. Эти протоколы обеспечивают важный стандартизированный подход для количественной оценки токсичности пептидов РАН в модели системы C.elegans. Описанные методы просты в обучении и недороги, могут быть выполнены быстро, и использовать воспроизводимые особенности системы C.elegans, такие как движение и воспроизводство.
При попытке этого протокола основной проблемой является получение последовательной пептидной токсичности и экспрессии РАН. Основными факторами контроля являются температура препарата, сроки перепадов температуры и подготовка анализных пластин. Для экспериментаторов важно последовательно классифицировать фенотипы животных в этом возрастном процессе анализа.
Визуальная демонстрация этого метода показывает их критерии классификации. Начните с заливки стандартной среды роста нематод с одной миллимолярной IPTG и 25 микрограмм на миллилитр карбенициллина в 24-хорошо пластин. Streak из РНК кормления клонов в HT115 бактерий на LB карбенициллин агар и расти их при 37 градусов по Цельсию в течение 24 часов.
На следующий день, выбрать одну колонию в один миллилитр LB карбенициллин жидких средств массовой информации и расти бактерии в течение 18 часов при 37 градусов по Цельсию при встряхивании при 250 об / мин. Найте четыре отдельных колодца NGM RNAi 24-хорошо пластины с 20 микролитров ночных бактериальных культур, как описано в рукописи текста и позволяют рнк бактерий, чтобы вызвать двойной мель РНК производства в одночасье. Используйте стандартный метод гипохлорита, чтобы изолировать яйца с первого дня взрослых C.elegans выражая интегрированный пептидный трансген РАН.
Затем семя около 30 яиц в каждый колодец из 24-хорошо пластины и инкубировать пластины при 20 градусов по Цельсию в течение семи дней. Для выполнения анализа скорости видео, приобрести два видео из двух отдельных скважин для каждого состояния РНК с помощью стерео рассечения микроскоп оснащен монохромной камерой. Убедитесь в том, чтобы использовать последовательные настройки приобретения между скважинами.
Для каждого видео установите продолжительность в 10 секунд и интервал времени до 76 миллисекунд. Установите время экспозиции изображения до четырех миллисекунд и используйте параметр масштабирования 1.49. Затем выберите два на два binning.
Убедитесь, что разрешение 800 на 600 пикселей и начать запись. После приобретения, этикетка каждое видео сразу же с напряжением, состояние RNAi и хорошо номер. Затем измерьте пройденное расстояние и длину каждого животного для 20 различных животных на видео, изучая в общей сложности около 40 червей для каждого состояния РНК.
В программном обеспечении выберите кнопку аннотации инструментов. Затем инструмент рисовать текст. Нажмите на точку в центре червя измеряется в первом кадре видео и пометить его с номером.
Заранее видео до конца при визуальном отслеживании червя. Затем нажмите на него и отметь его следующим соответствующим номером. Используйте инструмент бар масштаба притяжки, чтобы провести линию от первого числа до второго числа и записать расстояние, пройденное в электронной таблице.
Повторите это измерение для 19 других червей в видео, сохраняя при этом каждое отдельное измерение в окне анализа. После завершения измерений сделайте снимок последнего видеорамки, иллюстрирующей все линии измерения, чтобы данные можно было проследить до животного, из которого они возникли. Затем проанализируйте данные с помощью четырехкоголовой таблицы, где столбец один является идентификатором червя, а столбец второй — скоростью.
Время каждого видео можно найти, нажав правой кнопкой мыши на видео в рамках эксперимента и переходя к свойствам. Чтобы нормализовать измерение скорости, найти длину каждого животного. Используйте поликлинный инструмент для свободного отслеживания C.elegans от кончика головы до кончика хвоста.
Затем сделай снимок финальной видеорамки, иллюстрирующей все полилины. Длина линий будет записана по статистике. Добавьте два столбца в электронную таблицу, один для длины животного и один для нормализованной скорости.
Наконец, проанализируйте нормализованные данные о скорости с помощью одной из способов ANOVA с помощью пост-специального тестирования по сравнению с пустым вектором РНК. Поместите четыре-шесть трансгенных L4 C.elegans, выражаюющих пептид GFP РАН, на шестисемейную пластину GFP RNAi и выращивайте их при 20 градусах цельсия. Если в эксперименте используются РНК для проверки генетического воздействия на пептидную токсичность РАН, переместите 10 трансгенных гравидных взрослых к каждому из двух пустых векторных РНК РНК или генноспецифических РНК пластин.
Если мутанты используются для анализа генетического воздействия на пептидную токсичность РАН, поместите 10 гравидных диких животных или животных-мутантов, выражаюющих один и тот же трансген РАН, на каждую из двух пустых векторных РНК или РНК-тарелок GFP. Выращивайте их при 20 градусах по Цельсию в течение 48 часов. Выберите 10 наборов из 10 трансгенных L4 из пластин РНК и поместите каждый набор на трехметровой пластине РНК.
Убедитесь, что черви, отобранные для анализа все имеют поверхностно нормальную подвижность. Поместите пластины в полиэтиленовый пакет, чтобы сохранить влагу и инкубировать их при 25 градусах по Цельсию. Через 24 часа проанализируйте животных на подвижность, нажав на пластины на рассеченном микроскопе и проверив движение.
Если червь перемещается больше длины тела, считайте его мобильным и перенесите его на новую трехметровую пластину РНК. Используйте платиновый выбор, чтобы коснуться оставшихся червей на голове и хвосте. Если животное движется больше, чем длина тела, подсчитайте животное как мобильное и перенесите его на новую трехметровую пластину РНК.
Если на второй день не наблюдается значительного паралича при контроле пустого вектора, прекратите анализ и начните все сначала. Сгруппа всех неподвижных червей вместе, так что движение более чем длина тела могут быть легко обнаружены. Подсчитайте всех парализованных, упакованных или мертвых червей и отбросьте тарелку.
Продолжить забил животных для паралича каждый день в течение пяти-семи дней. Анализ роста был использован для измерения влияния ингибиций генов на токсичность дипептидов РАН, которые находятся у пациентов с ALS с повторным расширением G4C2. Выражение PR50 GFP только привело к полному аресту роста, но нокдаун нескольких генов подавлял токсичность развития.
Влияние специфических генных нокдаунов на подвижность развития PR50, выражаюющих животных, измерялось методом анализа скорости видео. Как и ожидалось, ингибирование экспрессии PR50 GFP привело к значительному увеличению подвижности по сравнению с пустым вектором РНК. Кроме того, РНК против протеасного подразделения RPN7 привели к значительному увеличению подвижности PR50.
Когда взрослые фенотипы были проанализированы с возрастной зависимости паралича анализа, PR50 GFP выставлены до 80%паралич к пяти дням возраста. Тем не менее, РНК, направленных на ген куль-6 значительно задерживается паралич, предполагая, что куль-6 требуется для PR50 GFP токсичности. Чтобы определить, если RAN белки вызывают невропатологии, когда выражается в C.elegans нейронов, нейрон-специфической токсичности был рассмотрен с помощью анализа комиссариата.
В день два взрослых, PR50 GFP выражение в моторных нейронов привело к значительному увеличению двигательных нейронов blebbing. Эта невропатология была значительно подавлена мутацией в гене рецептора инсулина IGF омолог DAF-2, который задерживает токсичные свойства нескольких нейродегенеративных белков. Для поведенческого анализа важно, чтобы пептиды РАН вынауют высокоперетративный фенотип.
Такие гены или препараты могут обеспечить новые биомаркеры или терапевтические возможности для пептидных заболеваний РАН. Используя эти анализы, мы выполнили геномный рнк-экран для супрессоров C9ORF72, связанных с пептидом RAN proline-arginine. Гены, выявленные на этом экране, включают в себя множество новых и сохраненных генов, которые будут предметом будущих механистических исследований.
