Мы хотели бы поблагодарить действующих и бывших членов ссылка лабораторию который участвовал в разработке протоколов, описанных здесь, в частности, Джин Фонте, который разработал оригинальную процедуру. Эта работа была поддержана награды от НИЗ (AG12423) и Ассоциации Альцгеймера (Zenith Award) в CDL

1) Подготовка нематода Рост Медиа пластины для паралич анализа. Паралич анализы выполняются на стандартных нематода рост средств массовой информации (НГО) пластин обычно используются для C. Элеганс распространения и генетики (Stiernagle, 2006). <ol><li> Автоклав NGM раствор, содержащий NaCl, Агар и пептон в колбу и добавить соответствующее количество стерильной CaCl 2, урацил, холестерина, 1M MgSO 4 и 1М КПО 4. Алиготе 10 мл жидкости NGM в каждую 60 мм х 15 мм чашки Петри. Разрешить NGM закрепить на ночь при комнатной температуре. </li><li> Если тестирование на эффекты соединений / экстракты, экстракт аликвоту на каждую тарелку и использовать распределитель, чтобы равномерно распределить экстракт по поверхности пластины. Разрешить экстракт для высыхания на ночь при комнатной температуре. Объемы более 1 мл, потребуется больше времени, чтобы высохнуть. </li><li> Пятно каждую тарелку с 250 мкл Е. палочки штамма OP5O выращивают в LB СМИ на ночь для оптической плотности 0.4-0.6. Разрешить бактерий для высыхания на ночь при комнатной температуре. </li></ol> Соответствующие переменные Возраст пластин имеет значительное влияние на паралич анализа, как пожилые пластины, как правило, высыхают. Использование пластин заливается в течение одной недели паралич анализа. Для идеальных результатов, залить пластин 3-4 дня до начала синхронной популяции червя [см. (2) ниже]. Для любого эксперимента, используют только пластины налил из той же партии. Изменение размера газона (например, пятнистых против распространения) и / или тип бактерий также изменить поведение червей. Паралич анализы могут быть выполнены с использованием альтернативных Е. штаммов в качестве источника пищи (например, HT115 напряжение, используемые в кормлении RNAi эксперименты), но это может измениться кинетика паралич, что требует соответствующего внутреннего контроля. 2) Подготовка Возраст-синхронную населения Worm Штамм CL4176 (SMG-1 (cc546 ц) I; dvIs27 [мио-3 / Ар minigene + РОЛ-6 (su1006) маркерный ген] X наиболее часто используется для опробования Ар-индуцированной паралич Этот штамм и другие трансгенные модели доступны. для академических исследователей за символическую плату от Caenorhabditis генетический центр (http://www.cbs.umn.edu/CGC/). <ol><li> Для обеспечения максимального возраста синхронность контрольной популяции желательно начать с синхронизированной родительского поколения. За неделю до начала паралича анализа испытаний населения, использование платины выбора червь для передачи 20-30 беременных взрослых на несколько 10 см NGM пластины распространяются с OP50 за 2 часа яйцо лежало на уровне 16 ° С (температура разрешительной CL4176 ). Удалить беременных взрослых и позволяют потомства расти в течение 7 дней, и к этому времени они будут &quot;второй день&quot; беременных взрослых. </li><li> (День 1) второй день беременной взрослых используются для приготовления возраст-синхронную населения тест. Для каждой экспериментальной состояние объекта для создания трех экземплярах чашки, содержащие 50-75 лет-синхронную червей. Использование палитры червь платины, передача 10-12 дня 2 взрослых беременных на 60 мм (10 мл объема) NGM пластины с пятнами OP50. Разрешить червей, чтобы отложить яйца на 16 ° С в течение 2 часов, затем обрывать взрослых и позволяют яйца люк и расти при 16 ° C. В этот момент лучше всего иметь кого-то, кто не будет забил пластины код них, так бомбардиром будет закрывать глаза на экспериментальных условиях. </li></ol> Соответствующие переменные Стадии эмбрионального развития, когда яиц (~ 26-клеточной стадии для дикого типа червей при оптимальных условиях) является функцией от взрослого возраста и питания. Если беременная взрослые используют для приготовления теста населения старше или морили голодом, позже яйца этапе будет проложена, снижение возраста синхронность населения и воспроизводимость паралич кинетики. Очень важно, чем моно-безбактериальный (т. е. только OP50 бактерий) культур используются (микробиологические загрязнения может серьезно повлиять на результаты анализа), а самая высокая воспроизводимость, если трех экземплярах пластины имеют схожие количество червей. 3) Трансгенные Индукция и паралич Пробирной <ol><li> (День 3) повышающую передачи пластин до 25 ° С через 48 часов после окончания синхронной яйцо лежало; черви должны быть на третьем личиночной стадии (L3). Плиты должны быть организованы без укладки в 25 ° С инкубатор, чтобы все пластин достигает 25 ° C, в то же время. </li><li> (День 4) Начало забив параличу червей (штамм CL4176) на 18-20 часов после начала повышающую передачи. На данный момент, все черви среди населения должна была достигнуть четвертой личиночной (L4) стадии. Продолжить забив в двух-часовой шагом, пока все черви на каждой из пластин парализована. По неизвестным причинам, паралич даже не по всей длине тела: голова регион последняя часть червя прекратить движение. Таким образом, соORMs которые в последнее время начаты паралич не может перевести через тарелку, но может двигаться головы, что позволит устранить бактерии вокруг переднего и оставляя &quot;гало&quot; очищенной бактерий. Эти черви неизменно становятся полностью парализована, и, следовательно, черви с ореолы классифицируются как парализованный. Некоторые черви не будет иметь ореолов, но и не показывают спонтанное движение, это проверено подталкивания с червем выбора. Если ткнул червь не может пройти полное волн тела на подталкивание, он также забил, как парализованный. Для эффективного скоринга, легче всего двигаться парализованным червей незапятнанным сектора тарелку так, чтобы они не будут непреднамеренно rescored следующего периода оценки. (Это также позволяет неправильной категории червей для демонстрации движения, что позволяет забив коррекция). </li><li> Для создания паралич кривой, в каждый момент времени доля червей на каждой пластине, которые не были парализованы преобразуется в процентах, и средний процент &quot;unparalyzed&quot; откладывается на время от повышающую передачи посвящения. (Обоснование для построения таким образом, что результирующая кривая формально аналогична кривой выживаемости, и таким образом могут быть проанализированы с использованием стандартных непараметрической статистики выживания.) </li></ol> Соответствующие переменные Повышающую передачи трансгенных червей myo-3/Aβ должно произойти, прежде чем они достигнут середины L4 почву для паралича, чтобы быть начаты, как мио-3 промоутер связано с развитием регулируется, и значительно сократил выражение в конце L4 или взрослых червей. Аналогичным образом, выражение этого трансгенов блокируется, если червей начинает не хватать, поэтому очень важно, чтобы черви сытых течение всего эксперимента. Мы никогда не наблюдали парализована червь для восстановления в любых условиях, а после 12-16 ч повышающую передачи, все CL4176 червей парализует, даже если они downshifted до 16 ° С. В CL4176 напряжение, достаточное регуляция экспрессии трансгена, чтобы вызвать паралич может произойти при более низких температурах (например, 20-25 ° С), хотя сроки паралича будут изменены. Паралич ставка зависит от конкретного штамма использовали трансгенных (мы построили myo-3/Aβ штаммы с быстрее и более медленными темпами, чем CL4176), так и с альтернативными штаммов забил окно может нуждаться в корректировке. 4) Результаты представитель Показанный на рисунке 1 представлена ​​зависимость паралича кривой CL4176, как необработанные и подвергаются 6,27 мМ кофеина (конечная концентрация в пластине НГО). Эта процедура приводит к высокой статистически значимой задержкой в ​​паралич примерно 4 часа, которые мы интерпретируем как свидетельствует о подавлении Ар токсичности в этой модели. Показанный на рисунке 2, независимый эксперимент опробование эффекты cafestol, другое соединение содержится в кофе. Этот участок является типичным для лечения, которые не влияют Ар токсичности. Обратите внимание, что в обоих экспериментах около половины необработанных CL4176 население парализовано на 24 часа в сутки, и паралич завершена на 28 час. Это типичные сроки паралич управления CL4176 населения. Значительные отклонения от этого времени свидетельствуют о изменили условия окружающей среды или спонтанное удаление трансгенов экземпляров. (CL4176 содержит хромосомно интегрированных трансгенных массив с несколькими копиями myo-3/Aβ трансгена. Хотя это трансгенные массив, как правило, достаточно стабилен, любое распространение деформации при температуре&gt; 16 ° C подберут для редких червей, которые прошли спонтанное удаление трансгенов, в результате чего в вариантах, которые будут иметь снижение Ар выражения и медленные результаты паралич.) <img src="/files/ftp_upload/2252/2252fig1.jpg" alt="Рисунок 1" /> Рисунок 1. Паралич кривой напряжение CL4176 червей неочищенных или подвергается 6,27 мМ кофеина (Sigma). Указано время от начала температуры повышающую передачи. Планки погрешностей = SEM <img src="/files/ftp_upload/2252/2252fig2.jpg" alt="Рисунок 2" /> Рисунок 2. Паралич кривой CL4176 червей воздействию 0,48 мм cafestol (Sigma). Баров Ошибка = SEM

<ol>
	<li>Arya, U., Dwivedi, H., Subramaniam, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reserpine+ameliorates+Abeta+toxicity+in+the+Alzheimer's+disease+model+in+Caenorhabditis+elegans.">Reserpine ameliorates Abeta toxicity in the Alzheimer's disease model in Caenorhabditis elegans.</a> Exp Gerontol. 44, 462-466 (2009).</li><li>Cohen, E., Bieschke, J., Perciavalle, R. M., Kelly, J. W., Dillin, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Opposing+activities+protect+against+age-onset+proteotoxicity.">Opposing activities protect against age-onset proteotoxicity.</a> Science. 313, 1604-1610 (2006).</li><li>Dosanjh, L. E., Brown, M. K., Rao, G., Link, C. D., Luo, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Behavioral+phenotyping+of+a+transgenic+C.+elegans+expressing+neuronal+amyloid-beta.">Behavioral phenotyping of a transgenic C. elegans expressing neuronal amyloid-beta.</a> J Alzheimers Dis. , (2009).</li><li>Drake, J., Link, C. D., Butterfield, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxidative+stress+precedes+fibrillar+deposition+of+Alzheimer's+disease+amyloid+beta-peptide+(1-42)+in+a+transgenic+Caenorhabditis+elegans+model.">Oxidative stress precedes fibrillar deposition of Alzheimer's disease amyloid beta-peptide (1-42) in a transgenic Caenorhabditis elegans model.</a> Neurobiol Aging. 24, 415-4120 (2003).</li><li>Fay, D. S., Fluet, A., Johnson, C. J., Link, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+aggregation+of+beta-amyloid+peptide+variants.">In vivo aggregation of beta-amyloid peptide variants.</a> J Neurochem. 71, 1616-1625 (1998).</li><li>Florez-McClure, M. L., Hohsfield, L. A., Fonte, G., Bealor, M. T., Link, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Decreased+insulin-receptor+signaling+promotes+the+autophagic+degradation+of+beta-amyloid+peptide+in+C.+elegans.">Decreased insulin-receptor signaling promotes the autophagic degradation of beta-amyloid peptide in C. elegans.</a> Autophagy. 3, 569-580 (2007).</li><li>Fonte, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Suppression+of+in+vivo+beta-amyloid+peptide+toxicity+by+overexpression+of+the+HSP-16.2+small+chaperone+protein.">Suppression of in vivo beta-amyloid peptide toxicity by overexpression of the HSP-16.2 small chaperone protein.</a> J Biol Chem. 283, 784-7891 (2008).</li><li>Hassan, W. M., Merin, D. A., Fonte, V., Link, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=AIP-1+ameliorates+beta-amyloid+peptide+toxicity+in+a+Caenorhabditis+elegans+Alzheimer's+disease+model.">AIP-1 ameliorates beta-amyloid peptide toxicity in a Caenorhabditis elegans Alzheimer's disease model.</a> Hum Mol Genet. 18, 2739-2747 (2009).</li><li>Link, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+human+beta-amyloid+peptide+in+transgenic+Caenorhabditis+elegans.">Expression of human beta-amyloid peptide in transgenic Caenorhabditis elegans.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 92, 9368-9372 (1995).</li><li>Link, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+expression+analysis+in+a+transgenic+Caenorhabditis+elegans+Alzheimer's+disease+model.">Gene expression analysis in a transgenic Caenorhabditis elegans Alzheimer's disease model.</a> Neurobiol Aging. 24, 397-413 (2003).</li><li>Stiernagle, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maintenance+of+C.+elegans.">Maintenance of C. elegans.</a> WormBook. , 1-11 (2006).</li><li>Wu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amyloid-beta-induced+pathological+behaviors+are+suppressed+by+Ginkgo+biloba+extract+EGb+761+and+ginkgolides+in+transgenic+Caenorhabditis+elegans.">Amyloid-beta-induced pathological behaviors are suppressed by Ginkgo biloba extract EGb 761 and ginkgolides in transgenic Caenorhabditis elegans.</a> J Neurosci. 26, 13102-13113 (2006).</li></ol>

Нет конфликта интересов объявлены.

Протокол мы описали могут быть эффективно использованы для анализа эффектов соединений на Ар токсичности. Опубликованные примеры включают эффекты Гинкго билоба трехсторонним (Wu и соавт. 2006) и резерпин (Арья и соавт. 2009). Соединения, которые были защитными против Ар токсичности в других системах, также было показано, что защитное в этой модели (например, мемантин, наши неопубликованные результаты). Важным обоснованием для создания этой модели является то, что хорошо развитая генетические и молекулярные инструменты, доступные в C. Элеганс могут быть использованы для исследования механизмов Ар токсичности. Таким образом, эффекты специфических мутаций на Ар токсичности могут быть проанализированы (например, эффект снижения инсулиноподобный сигнализации путем введения DAF-2 с потерей функции мутации, Флорес-МакКлюр и соавт. 2007), и эта модель также может быть использована для изучения влияния на выражение трансгены (Фонте и соавт. 2008). В последнее время мы широко использовали эту модель для изучения воздействия на токсичность одного аминокислотных замен в Ар (неопубликованные данные). Трансгенные модели, описанной здесь анализы эффект острого Ар выражение мышечной функции клетки. Во время паралича мышечных клеток и их саркомера не повреждены; паралич фенотип не является результатом мышечного гибели клеток. Однако, после паралича (~ 48 часов после первоначального повышающую передачи) существует распад целостности мышц и возможной гибели червей. Мы не исследовали этот эффект ниже по течению от Ар выражение или использовали его в качестве маркера токсичности. Выражение индуцибельной Ар модели, описанной здесь не подходит для исследования лечения, которые модулируют β-амилоида образованию как таковому. Хотя трансгенные червей с учредительными форма выражения Ар легко обнаружить отложения амилоида (Фэй и др., 1998;.. Ссылка и др. 2001), трансгенные червей с индуцибельной выражение Ар редко амилоидных отложений и паралич фенотип появляется независимо от амилоида (Drake и соавт. 2003). Наши результаты согласуются с мнением, что острая токсичность индуцированных Ар выражение результатов накопления растворимых олигомерных Ар, не амилоидных отложений.

<table border="1"><tbody><tr><td> Реагенты </td><td> Quantity/2L </td><td> Компания / Catalogue # </td><td> Комментарии </td></tr><tr><td> NaCl </td><td> 6g </td><td> Sigma-Aldrich / S9888 </td><td></td></tr><tr><td> Агар </td><td> 40г </td><td> Sigma-Aldrich / A7002 </td><td></td></tr><tr><td> Пептон </td><td> 5г </td><td> Sigma-Aldrich / P0556 </td><td></td></tr><tr><td> DDH 2 O </td><td> 2L </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 1М CaCl 2 </td><td> 2 мл </td><td></td><td> 147.02mg/mL в DDH 2 O </td></tr><tr><td> Урацил </td><td> 2 мл </td><td></td><td> 2mg/mL в DDH 2 O </td></tr><tr><td> Холестерин </td><td> 2 мл </td><td></td><td> 5mg/mL в этаноле (не автоклав) </td></tr><tr><td> 1M MgSO 4 </td><td> 2 мл </td><td></td><td> 246.5mg/mL в DDH 2 O </td></tr><tr><td> 1M КПО 4 </td><td> 50 мл </td><td></td><td> 98mg KH 2 PO 4. Мл, 48mg K2HPO4/mL в DDH 2 O, рН </td></tr><tr><td> Коническая колба Эрленмейера </td><td></td><td> VWR </td><td></td></tr></tbody></table>

assaying &beta;-amyloid toxicity using a transgenic c. elegans model

Накопление β-амилоида пептида (Ар), как правило, считается, что центральное место в индукции болезни Альцгеймера, но и соответствующий механизм (ы) токсичности по-прежнему неясны. Ар также хранение внутримышечно Включение миозит, миопатия тяжелой человека. Интенсивно изучал нематод Caenorhabditis Элеганс червя может быть transgenically спроектирован, чтобы выразить человеческие Ар. В зависимости от ткани или сроки Ар выражение, трансгенные червей может быть легко измеримы фенотипы, которые служат для чтения из Ар токсичности. Например, трансгенные червей с пан-нейронов Ар выражения имеют дефекты ассоциативно обучения (Dosanjh и др. 2009 год.), А трансгенные червей с учредительными мышц конкретное выражение показать прогрессивный, возраст-зависимых фенотип паралич (Link, 1995; Коэн и др. . 2006). Одним из наиболее полезных C. Элеганс модель использует чувствительные к температуре мутации в системе наблюдения мРНК для инженера температуры индуцибельной мышц выражение Ар трансгенов, в результате чего воспроизводимый фенотип паралич от температуры повышающую передачи (Link и соавт. 2003). Методы лечения, которые счетчик Ар токсичности в этой модели [например, выражение защитные трансгенов (Хасан и соавт. 2009) или воздействия экстракта гинкго билоба (Wu и соавт. 2006)] воспроизводимо изменять скорость паралич индуцированных температурой повышающую передачи этих трансгенных червей. Здесь мы описываем наш протокол для измерения скорости паралич в этой трансгенных C. Элеганс модели, обращая особое внимание на экспериментальных переменных, которые могут повлиять на это измерение.

Watch this Scientific Journal Video about Assaying Î²-amyloid Toxicity using a Transgenic C. elegans Model at JoVE.com

Assaying &amp;#946;-amyloid Toxicity using a Transgenic C. elegans Model

Интенсивно изучал нематод червь<em&gt; Caenorhabditis Элеганс</em&gt; Может быть transgenically спроектирован, чтобы выразить человеческий β-амилоида пептида (Ар). Индуцированная экспрессия в Ар<em&gt; С. Элеганс</em&gt; Мышц приводит к быстрому, воспроизводимые фенотип паралич, который может использоваться для мониторинга лечения, которые модулируют Ар токсичности.

Опробование β-амилоида Токсичность использованием трансгенных С. Элеганс Модель

Accumulation of the &beta;-amyloid peptide (A&beta;) is generally believed to be central to the induction of Alzheimer's disease, but the relevant ...

assaying-amyloid-toxicity-using-a-transgenic-c-elegans-model

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Assaying &beta;-amyloid Toxicity using a Transgenic C. elegans Model

25.2K Views.  University of Colorado. Интенсивно изучал нематод червь Caenorhabditis Элеганс Может быть transgenically спроектирован, чтобы выразить человеческий β-амилоида пептида (Ар). Индуцированная экспрессия в Ар С. Элеганс Мышц приводит к быстрому, воспроизводимые фенотип паралич, котор?...

Video: Assaying &#946;-amyloid Toxicity using a Transgenic C. elegans Model

Assaying Locomotor Activity to Study Circadian Rhythms and Sleep Parameters in Drosophila

Most life forms exhibit daily rhythms in cellular, physiological and behavioral phenomena that are driven by endogenous circadian (&equiv;24 hr) pacemakers or clocks. Malfunctions in the human circadian system are associated with numerous diseases or disorders. Much progress towards our understanding of the mechanisms underlying circadian rhythms has emerged from genetic screens whereby an easily measured behavioral rhythm is used as a read-out of clock function. Studies using Drosophila have made seminal contributions to our understanding of the cellular and biochemical bases underlying circadian rhythms. The standard circadian behavioral read-out measured in Drosophila is locomotor activity. In general, the monitoring system involves specially designed devices that can measure the locomotor movement of Drosophila. These devices are housed in environmentally controlled incubators located in a darkroom and are based on using the interruption of a beam of infrared light to record the locomotor activity of individual flies contained inside small tubes. When measured over many days, Drosophila exhibit daily cycles of activity and inactivity, a behavioral rhythm that is governed by the animal's endogenous circadian system. The overall procedure has been simplified with the advent of commercially available locomotor activity monitoring devices and the development of software programs for data analysis. We use the system from Trikinetics Inc., which is the procedure described here and is currently the most popular system used worldwide. More recently, the same monitoring devices have been used to study sleep behavior in Drosophila. Because the daily wake-sleep cycles of many flies can be measured simultaneously and only 1 to 2 weeks worth of continuous locomotor activity data is usually sufficient, this system is ideal for large-scale screens to identify Drosophila manifesting altered circadian or sleep properties.

Assaying Locomotor Activity to Study Circadian Rhythms and Sleep Parameters in Drosophila

We describe procedures for recording daily locomotor activity rhythms of Drosophila and subsequent data analysis. Locomotor activity rhythms are a reliable behavioral output of animal circadian clocks and are used as the standard readout of clock function when studying circadian mutants or examining how the environment regulates the circadian system.

Опробование двигательную активность по изучению циркадные ритмы сна и параметров в Drosophila</em

Most life forms exhibit daily rhythms in cellular, physiological and behavioral phenomena that are driven by endogenous circadian (&equiv;24 hr) ...

In vivo Laser Axotomy in C. elegans

Neurons communicate with other cells via axons and dendrites, slender membrane extensions that contain pre- or post-synaptic specializations. If a neuron is damaged by injury or disease, it may regenerate. Cell-intrinsic and extrinsic factors influence the ability of a neuron to regenerate and restore function. Recently, the nematode C. elegans has emerged as an excellent model organism to identify genes and signaling pathways that influence the regeneration of neurons1-6. The main way to initiate neuronal regeneration in C. elegans is laser-mediated cutting, or axotomy. During axotomy, a fluorescently-labeled neuronal process is severed using high-energy pulses. Initially, neuronal regeneration in C. elegans was examined using an amplified femtosecond laser5. However, subsequent regeneration studies have shown that a conventional pulsed laser can be used to accurately sever neurons in vivo and elicit a similar regenerative response1,3,7.
We present a protocol for performing in vivo laser axotomy in the worm using a MicroPoint pulsed laser, a turnkey system that is readily available and that has been widely used for targeted cell ablation. We describe aligning the laser, mounting the worms, cutting specific neurons, and assessing subsequent regeneration. The system provides the ability to cut large numbers of neurons in multiple worms during one experiment. Thus, laser axotomy as described herein is an efficient system for initiating and analyzing the process of regeneration.

In vivo Laser Axotomy in C. elegans

A protocol to cut neurons in C. elegans with a MicroPoint pulsed laser is presented. We describe setting up the system, immobilizing worms, and severing labeled neurons. Advantages include a relatively low-cost system and the ability to sever neuronal processes or ablate cells in vivo.

В естественных условиях лазерной Axotomy на языке C. Элеганс

Neurons communicate with other cells via axons and dendrites, slender membrane extensions that contain pre- or post-synaptic specializations. If a neuron ...

Automated Quantification of Synaptic Fluorescence in C. elegans

Synapse strength refers to the amplitude of postsynaptic responses to presynaptic neurotransmitter release events, and has a major impact on overall neural circuit function. Synapse strength critically depends on the abundance of neurotransmitter receptors clustered at synaptic sites on the postsynaptic membrane. Receptor levels are established developmentally, and can be altered by receptor trafficking between surface-localized, subsynaptic, and intracellular pools, representing important mechanisms of synaptic plasticity and neuromodulation. Rigorous methods to quantify synaptically-localized neurotransmitter receptor abundance are essential to study synaptic development and plasticity. Fluorescence microscopy is an optimal approach because it preserves spatial information, distinguishing synaptic from non-synaptic pools, and discriminating among receptor populations localized to different types of synapses. The genetic model organism Caenorhabditis elegans is particularly well suited for these studies due to the small size and relative simplicity of its nervous system, its transparency, and the availability of powerful genetic techniques, allowing examination of native synapses in intact animals.
Here we present a method for quantifying fluorescently-labeled synaptic neurotransmitter receptors in C. elegans. Its key feature is the automated identification and analysis of individual synapses in three dimensions in multi-plane confocal microscope output files, tabulating position, volume, fluorescence intensity, and total fluorescence for each synapse. This approach has two principal advantages over manual analysis of z-plane projections of confocal data. First, because every plane of the confocal data set is included, no data are lost through z-plane projection, typically based on pixel intensity averages or maxima. Second, identification of synapses is automated, but can be inspected by the experimenter as the data analysis proceeds, allowing fast and accurate extraction of data from large numbers of synapses. Hundreds to thousands of synapses per sample can easily be obtained, producing large data sets to maximize statistical power. Considerations for preparing C. elegans for analysis, and performing confocal imaging to minimize variability between animals within treatment groups are also discussed. Although developed to analyze C. elegans postsynaptic receptors, this method is generally useful for any type of synaptically-localized protein, or indeed, any fluorescence signal that is localized to discrete clusters, puncta, or organelles.
The procedure is performed in three steps: 1) preparation of samples, 2) confocal imaging, and 3) image analysis. Steps 1 and 2 are specific to C. elegans, while step 3 is generally applicable to any punctate fluorescence signal in confocal micrographs.

Automated Quantification of Synaptic Fluorescence in C. elegans

The abundance of neurotransmitter receptors clustered at synapses strongly influences synaptic strength. This method quantifies fluorescently-labeled neurotransmitter receptors in three dimensions with single-synapse resolution in C. elegans, allowing hundreds of synapses to be rapidly characterized within a single sample without distortions introduced by z-plane projection.

Автоматизированная количественная оценка Synaptic флуоресценции в<em&gt; С. Элеганс</em

Synapse strength refers to the amplitude of postsynaptic responses to presynaptic neurotransmitter release events, and has a major impact on overall ...

C. elegans Tracking and Behavioral Measurement

We have developed instrumentation, image processing, and data analysis techniques to quantify the locomotory behavior of C. elegans as it crawls on the surface of an agar plate. For the study of the genetic, biochemical, and neuronal basis of behavior, C. elegans is an ideal organism because it is genetically tractable, amenable to microscopy, and shows a number of complex behaviors, including taxis, learning, and social interaction1,2. Behavioral analysis based on tracking the movements of worms as they crawl on agar plates have been particularly useful in the study of sensory behavior3, locomotion4, and general mutational phenotyping5. Our system works by moving the camera and illumination system as the worms crawls on a stationary agar plate, which ensures no mechanical stimulus is transmitted to the worm. Our tracking system is easy to use and includes a semi-automatic calibration feature. A challenge of all video tracking systems is that it generates an enormous amount of data that is intrinsically high dimensional. Our image processing and data analysis programs deal with this challenge by reducing the worms shape into a set of independent components, which comprehensively reconstruct the worms behavior as a function of only 3-4 dimensions6,7. As an example of the process we show that the worm enters and exits its reversal state in a phase specific manner.

C. elegans Tracking and Behavioral Measurement

We have developed a video-rate tracking microscope system that can record and quantify C. elegans behavior at high resolution and high speeds. We have also developed computational methods to reduce the dimensionality of the worm images to a fundamental set of measurements that completely describe the shape of the worm.

C. Элеганс отслеживания и поведенческих измерений

We have developed instrumentation, image processing, and data analysis techniques to quantify the locomotory behavior of C. elegans as it crawls on the ...

A Molecular Readout of Long-term Olfactory Adaptation in C. elegans

During sustained stimulation most sensory neurons will adapt their response by decreasing their sensitivity to the signal. The adaptation response helps shape attention and also protects cells from over-stimulation. Adaptation within the olfactory circuit of C. elegans was first described by Colbert and Bargmann1,2. Here, the authors defined parameters of the olfactory adaptation paradigm, which they used to design a genetic screen to isolate mutants defective in their ability to adapt to volatile odors sensed by the Amphid Wing cells type C (AWC) sensory neurons. When wildtype C. elegans animals are exposed to an attractive AWC-sensed odor3 for 30 min they will adapt their responsiveness to the odor and will then ignore the adapting odor in a chemotaxis behavioral assay for ~1 hr. When wildtype C. elegans animals are exposed to an attractive AWC-sensed odor for ~1 hr they will then ignore the adapting odor in a chemotaxis behavioral assay for ~3 hr. These two phases of olfactory adaptation in C. elegans were described as short-term olfactory adaptation (induced after 30 min odor exposure), and long-term olfactory adaptation (induced after 60 min odor exposure). Later work from L'Etoile et al.,4 uncovered a Protein Kinase G (PKG) called EGL-4 that is required for both the short-term and long-term olfactory adaptation in AWC neurons. The EGL-4 protein contains a nuclear localization sequence that is necessary for long-term olfactory adaptation responses but dispensable for short-term olfactory adaptation responses in the AWC4. By tagging EGL-4 with a green fluorescent protein, it was possible to visualize the localization of EGL-4 in the AWC during prolonged odor exposure. Using this fully functional GFP-tagged EGL-4 (GFP::EGL-4) molecule we have been able to develop a molecular readout of long-term olfactory adaptation in the AWC5. Using this molecular readout of olfactory adaptation we have been able to perform both forward and reverse genetic screens to identify mutant animals that exhibit defective subcellular localization patterns of GFP::EGL-4 in the AWC6,7. Here we describe: 1) the construction of GFP::EGL-4 expressing animals; 2) the protocol for cultivation of animals for long-term odor-induced nuclear translocation assays; and 3) the scoring of the long-term odor-induced nuclear translocation event and recovery (re-sensitization) from the nuclear GFP::EGL-4 state.

A Molecular Readout of Long-term Olfactory Adaptation in C. elegans

Here we describe a molecular readout of long-term olfactory adaptation in Caenorhabditis elegans. The Protein Kinase G, EGL-4, is necessary for stable adaptation responses in the primary sensory neuron pair called AWC. During prolonged odor exposure EGL-4 translocates from the cytosol to nucleus of the AWC.

Молекулярная Считывание Долгосрочные обонятельной адаптации в<em&gt; C. Элеганс</em

During sustained stimulation most sensory neurons will adapt their response by decreasing their sensitivity to the signal. The adaptation response helps ...

Assaying DNA Damage in Hippocampal Neurons Using the Comet Assay

A number of drugs target the DNA repair pathways and induce cell kill by creating DNA damage. Thus, processes to directly measure DNA damage have been extensively evaluated. Traditional methods are time consuming, expensive, resource intensive and require replicating cells. In contrast, the comet assay, a single cell gel electrophoresis assay, is a faster, non-invasive, inexpensive, direct and sensitive measure of DNA damage and repair. All forms of DNA damage as well as DNA repair can be visualized at the single cell level using this powerful technique.
	The principle underlying the comet assay is that intact DNA is highly ordered whereas DNA damage disrupts this organization. The damaged DNA seeps into the agarose matrix and when subjected to an electric field, the negatively charged DNA migrates towards the cathode which is positively charged. The large undamaged DNA strands are not able to migrate far from the nucleus. DNA damage creates smaller DNA fragments which travel farther than the intact DNA. Comet Assay, an image analysis software, measures and compares the overall fluorescent intensity of the DNA in the nucleus with DNA that has migrated out of the nucleus. Fluorescent signal from the migrated DNA is proportional to DNA damage. Longer brighter DNA tail signifies increased DNA damage. Some of the parameters that are measured are tail moment which is a measure of both the amount of DNA and distribution of DNA in the tail, tail length and percentage of DNA in the tail. This assay allows to measure DNA repair as well since resolution of DNA damage signifies repair has taken place. The limit of sensitivity is approximately 50 strand breaks per diploid mammalian cell 1,2. Cells treated with any DNA damaging agents, such as etoposide, may be used as a positive control. Thus the comet assay is a quick and effective procedure to measure DNA damage.

The comet assay is an efficient way of detecting single- and double-strand breaks, including alkali-labile sites and DNA-DNA/DNA-protein cross-links on the DNA in all cells including hippocampal neurons. The method takes advantage of the differential migration of DNA in an electric field due to differences in amount of DNA damage.

Пробирного повреждений ДНК в нейронах гиппокампа с помощью комет

A number of drugs target the DNA repair pathways and induce cell kill by creating DNA damage. Thus, processes to directly measure DNA damage have been ...

In vivo Neuronal Calcium Imaging in C. elegans

The nematode worm C. elegans is an ideal model organism for relatively simple, low cost neuronal imaging in vivo. Its small transparent body and simple, well-characterized nervous system allows identification and fluorescence imaging of any neuron within the intact animal. Simple immobilization techniques with minimal impact on the animal's physiology allow extended time-lapse imaging. The development of genetically-encoded calcium sensitive fluorophores such as cameleon 1 and GCaMP 2 allow in vivo imaging of neuronal calcium relating both cell physiology and neuronal activity. Numerous transgenic strains expressing these fluorophores in specific neurons are readily available or can be constructed using well-established techniques. Here, we describe detailed procedures for measuring calcium dynamics within a single neuron in vivo using both GCaMP and cameleon. We discuss advantages and disadvantages of both as well as various methods of sample preparation (animal immobilization) and image analysis. Finally, we present results from two experiments: 1) Using GCaMP to measure the sensory response of a specific neuron to an external electrical field and 2) Using cameleon to measure the physiological calcium response of a neuron to traumatic laser damage. Calcium imaging techniques such as these are used extensively in C. elegans and have been extended to measurements in freely moving animals, multiple neurons simultaneously and comparison across genetic backgrounds. C. elegans presents a robust and flexible system for in vivo neuronal imaging with advantages over other model systems in technical simplicity and cost.

In vivo Neuronal Calcium Imaging in C. elegans

With its small transparent body, well-documented neuroanatomy and a host of amenable genetic techniques and reagents, C. elegans makes an ideal model organism for in vivo neuronal imaging using relatively simple, low-cost techniques. Here we describe single neuron imaging within intact adult animals using genetically encoded fluorescent calcium indicators.

В естественных нейронных изображений кальция в C. Элеганс

The nematode worm C. elegans is an ideal model organism  for relatively simple, low cost neuronal imaging in vivo. Its small transparent body and simple, ...

A Caenorhabditis elegans Model System for Amylopathy Study

Amylopathy is a term that describes abnormal synthesis and accumulation of amyloid beta (A&beta;) in tissues with time. A&beta; is a hallmark of Alzheimer's disease (AD) and is found in Lewy body dementia, inclusion body myositis and cerebral amyloid angiopathy 1-4. Amylopathies progressively develop with time. For this reason simple organisms with short lifespans may help to elucidate molecular aspects of these conditions. Here, we describe experimental protocols to study A&beta;-mediated neurodegeneration using the worm Caenorhabditis elegans. Thus, we construct transgenic worms by injecting DNA encoding human A&beta;42 into the syncytial gonads of adult hermaphrodites. Transformant lines are stabilized by a mutagenesis-induced integration. Nematodes are age synchronized by collecting and seeding their eggs. The function of neurons expressing A&beta;42 is tested in opportune behavioral assays (chemotaxis assays). Primary neuronal cultures obtained from embryos are used to complement behavioral data and to test the neuroprotective effects of anti-apoptotic compounds.

A Caenorhabditis elegans Model System for Amylopathy Study

We describe methods to study aspects of amylopathies in the worm C. elegans. We show how to construct worms expressing human A&beta;42 in neurons and how to test their function in behavioral assays. We further show how to obtain primary neuronal cultures that can be used for pharmacological testing.

<em&gt; Caenorhabditis Элеганс</em&gt; Модельной системы для исследования Amylopathy

Amylopathy is a term that describes abnormal synthesis and accumulation of amyloid beta (A&beta;) in tissues with time. A&beta; is a hallmark of ...

Visualizing Neuroblast Cytokinesis During C. elegans Embryogenesis

This protocol describes the use of fluorescence microscopy to image dividing cells within developing Caenorhabditis elegans embryos. In particular, this protocol focuses on how to image dividing neuroblasts, which are found underneath the epidermal cells and may be important for epidermal morphogenesis. Tissue formation is crucial for metazoan development&#160;and relies on external cues from neighboring tissues. C. elegans is an excellent model organism to study tissue morphogenesis in vivo due to its transparency and simple organization, making its tissues easy to study via microscopy. Ventral enclosure is the process where the ventral surface of the embryo is covered by a single layer of epithelial cells. This event is thought to be facilitated by the underlying neuroblasts, which provide chemical guidance cues to mediate migration of the overlying epithelial cells. However, the neuroblasts are highly proliferative and also may act as a mechanical substrate for the ventral epidermal cells. Studies using this experimental protocol could uncover the importance of intercellular communication during tissue formation, and could be used to reveal the roles of genes involved in cell division within developing tissues.

Visualizing Neuroblast Cytokinesis During C. elegans Embryogenesis

This protocol describes how to image dividing cells within a tissue in Caenorhabditis elegans embryos. While several protocols describe how to image cell division in the early embryo, this protocol describes how to image cell division within a developing tissue during mid late embryogenesis.

Визуализация нейробласта Цитокинез Во<em&gt; С. Элеганс</em&gt; Эмбриогенеза

This protocol describes the use of fluorescence microscopy to image dividing cells within developing Caenorhabditis elegans embryos. In particular, this ...

In Vivo Imaging of Dauer-specific Neuronal Remodeling in C. elegans

The mechanisms controlling stress-induced phenotypic plasticity in animals are frequently complex and difficult to study in vivo. A classic example of stress-induced plasticity is the dauer stage of C. elegans. Dauers are an alternative developmental larval stage formed under conditions of low concentrations of bacterial food and high concentrations of a dauer pheromone. Dauers display extensive developmental and behavioral plasticity. For example, a set of four inner-labial quadrant (IL2Q) neurons undergo extensive reversible remodeling during dauer formation. Utilizing the well-known environmental pathways regulating dauer entry, a previously established method for the production of crude dauer pheromone from large-scale liquid nematode cultures is demonstrated. With this method, a concentration of 50,000 - 75,000 nematodes/ml of liquid culture is sufficient to produce a highly potent crude dauer pheromone. The crude pheromone potency is determined by a dose-response bioassay. Finally, the methods used for in vivo time-lapse imaging of the IL2Qs during dauer formation are described.

In Vivo Imaging of Dauer-specific Neuronal Remodeling in C. elegans

Following exposure to specific environmental stressors, the nematode Caenorhabditis elegans undergoes extensive phenotypic plasticity to enter into a stress-resistant &#8216;dauer&#8217; juvenile stage. We present methods for the controlled induction and imaging of neuroplasticity during dauer.

В естественных изображений из Dauer конкретным нейронов ремоделирования в C. Элеганс

The mechanisms controlling stress-induced phenotypic plasticity in animals are frequently complex and difficult to study in vivo. A classic example of ...