Наш протокол помогает ответить на вопросы о том, как физические упражнения поддерживают гомеостаз организма. Системы позволили нам препарировать прямое механическое воздействие на мозг от сложных последствий физических нагрузок, таких как ходьба и бег трусцой. Для начала закрепите акселерометр поверх головы крысы с помощью хирургической ленты.
После полного восстановления после анестезии поместите крысу в тренажер беговой дорожки. Отрегулируйте беговую дорожку до умеренной скорости в 20 метров в минуту. Используйте прикладное программное обеспечение для измерения величины вертикальных ускорений вдоль осей X, Y и Z, когда крыса работает на беговой дорожке.
Сопоставьте значения, полученные от программного обеспечения, с величиной в частоте вертикального ускорения в системе PHM. Предустановлена амплитуда колебаний платформы и скорость вращения кулачка пропеллера. Затем поместите мышь в положение лежа с головой, расположенной на колеблющейся, а остальной частью тела на статических платформах.
Включите двигатель, чтобы колебать платформу вертикально и применить PHM к мыши. В прозрачном пластиковом корпусе настройте видеокамеру со скоростью кадров 24 FPS для записи всего пространства. Затем внутрибрюшинно вводят мышь пять гидрокситриптофана.
Поместите мышь в прозрачную клетку и начните запись в течение 30 минут. Просмотрите записанное видео на скорости 0,5x и подсчитайте подергивание головы вручную. Извлеките криосекции мозга мыши из слайд-бокса.
Оставьте слайды на чистых салфетках при комнатной температуре до тех пор, пока образцы полностью не обезвоживаются. Используйте ручку блокатора жидкости, чтобы нарисовать круг вокруг криосекционной ткани. Затем добавьте раствор TBS-T.
На дно лотка поместите влажные салфетки, чтобы создать влажную среду для горок. После пермеабляции TBS-T добавляют 4% ослиную сыворотку для блокировки и инкубируют при комнатной температуре в течение одного часа. Промойте слайды один раз, погрузившись в TBS-T на пять минут.
Затем нанесите 100 микролитров соответствующим образом разбавленного первичного антитела и смеси dappy на каждый слайд. Накройте лоток и высиживайте при комнатной температуре на ночь. После инкубации промыть TBS-T трижды в течение пяти минут каждый.
Применяют 100 микролитров соответствующим образом разбавленных видов флуоресцентных вторичных антител и инкубируют при комнатной температуре в течение одного часа. Послеполаскивайте TBS-T трижды в течение пяти минут каждая, монтируйте горки монтажным носителем и накрываете горки крышкой. После монтажа просмотрите образец под флуоресцентным микроскопом.
Система PHM была скорректирована для получения пиков вертикального ускорения примерно в 1,0 раза больше G, что было эквивалентно головам крыс во время бега на беговой дорожке. Применение PHM к мышам значительно ослабило их реакцию на подергивание головы по сравнению с контрольными мышами, представляющими супрессивный эффект PHM на передачу сигналов рецептора 5-HT2A в нейронах префронтальной коры. Беговая дорожка в PHM значительно улучшила интернализацию рецепторов 5-HT2A и нейроны префронтальной коры мыши.
Количественная оценка интернализованных и связанных с мембраной положительных областей рецептора 5-HT2A относительно новой и положительной области подтвердила это наблюдение. Иммуноокрашивание и количественная оценка экспрессии c-Fos в положительных нейронах рецептора 5-HT2A показали, что беговая дорожка в PHM снижает регуляцию экспрессии c-Fos, индуцированной 5-HTP. Это последующее клеточное событие активации рецептора 5-HT2A и нейронов PFC мыши.
Механическое вмешательство может быть применено к частям тела, отличным от головы, для исследования механических аспектов эффектов упражнений.
