Nosso protocolo ajuda a responder às perguntas de como o exercício físico suporta a homeostase do organismo. Os sistemas nos permitiram dissecar efeitos mecânicos diretos no cérebro a partir de consequências complexas de atividades físicas, como caminhar e correr. Para começar, fixe o acelerômetro no topo da cabeça de um rato usando fita cirúrgica.
Após a recuperação completa da anestesia, coloque o rato na máquina da esteira. Ajuste a esteira para uma velocidade moderada a 20 metros por minuto. Use o software aplicativo para medir a magnitude das acelerações verticais ao longo dos eixos X, Y e Z quando o rato estiver executando a esteira.
Corresponder os valores obtidos a partir do software com a magnitude em frequência de aceleração vertical no sistema PHM. Predefina a amplitude de oscilação da plataforma e a velocidade de rotação do cames em forma de hélice. Em seguida, coloque o mouse em uma posição prona com a cabeça localizada no oscilável e o resto do corpo nas plataformas estáticas.
Ligue o motor para oscilar a plataforma verticalmente e aplique PHM no mouse. Na caixa de plástico transparente, configure a câmera de vídeo a uma taxa de quadros de 24 FPS para gravar todo o espaço. Em seguida, administrar por via intraperitoneal cinco hidroxitriptofano a um rato.
Coloque o mouse na gaiola transparente e comece a gravar por 30 minutos. Revise o vídeo gravado a uma velocidade de 0,5x e conte a cabeça se contorcendo manualmente. Recupere as criosecções do cérebro do rato a partir da caixa de diapositivos.
Deixe as lâminas em toalhetes limpos à temperatura ambiente até que as amostras desidratem completamente. Use uma caneta bloqueadora de líquido para desenhar um círculo ao redor do tecido criosseccionado. Em seguida, adicione a solução TBS-T.
Na parte inferior de uma bandeja, coloque lenços umedecidos para criar um ambiente úmido para os slides. Após uma permeablização com TBS-T, adicionar soro de burro a 4% para bloqueio e incubar à temperatura ambiente por uma hora. Enxaguar as lâminas uma vez por imersão em TBS-T por cinco minutos.
Em seguida, aplique 100 microlitros de anticorpo primário adequadamente diluído e mistura de dappy em cada lâmina. Cubra a bandeja e incube à temperatura ambiente durante a noite. Após a incubação, enxaguar com TBS-T três vezes por cinco minutos cada.
Aplicar 100 microlitros de espécies adequadamente diluídas em combinação com o anticorpo secundário fluorescente e incubar à temperatura ambiente durante uma hora. Pós-lave com TBS-T três vezes por cinco minutos cada, monte as lâminas com meio de montagem e cubra as lâminas com deslizamentos de cobertura. Após a montagem, veja a amostra sob um microscópio de fluorescência.
O sistema PHM foi ajustado para produzir picos de aceleração vertical de aproximadamente 1,0 vezes G, o que foi equivalente aos das cabeças dos ratos durante a corrida em esteira. A aplicação de PHM em camundongos atenuou significativamente sua resposta de contração da cabeça em comparação com os camundongos de controle que representam um efeito supressor do PHM na sinalização do receptor 5-HT2A nos neurônios do córtex pré-frontal. A corrida em esteira em PHM aumentou significativamente a internalização do receptor 5-HT2A e os neurônios do córtex pré-frontal do rato.
A quantificação de áreas positivas para o receptor 5-HT2A internalizado e associado à membrana em relação à área nova e positiva confirmou essa observação. A imunocoloração e quantificação da expressão de c-Fos em neurônios positivos para o receptor 5-HT2A mostraram que a corrida em esteira em PHM regulou negativamente a expressão de 5-HTP induziu c-Fos. Este é o evento celular a jusante da ativação do receptor 5-HT2A e dos neurônios PFC do rato.
A intervenção mecânica pode ser aplicada a outras partes do corpo além da cabeça para investigar os aspectos mecânicos dos efeitos do exercício.
