Il nostro protocollo aiuta a rispondere alle domande su come l'esercizio fisico supporta l'omeostasi dell'organismo. I sistemi ci hanno permesso di analizzare gli effetti meccanici diretti sul cervello dalle complesse conseguenze di attività fisiche come camminare e fare jogging. Per iniziare, fissare l'accelerometro sulla parte superiore della testa di un topo usando del nastro chirurgico.
Dopo il completo recupero dall'anestesia, posizionare il topo nella macchina del tapis roulant. Regolare il tapis roulant a una velocità moderata a 20 metri al minuto. Utilizzare il software applicativo per misurare l'entità delle accelerazioni verticali lungo gli assi X, Y e Z quando il topo sta correndo sul tapis roulant.
Abbinare i valori ottenuti dal software alla grandezza in frequenza dell'accelerazione verticale nel sistema PHM. Preimpostare l'ampiezza di oscillazione della piattaforma e la velocità di rotazione della camma a forma di elica. Quindi posizionare il mouse in posizione prona con la testa situata sull'oscillabile e il resto del corpo sulle piattaforme statiche.
Accendere il motore per far oscillare la piattaforma verticalmente e applicare PHM al mouse. Nella custodia in plastica trasparente, imposta la videocamera a un frame rate di 24 FPS per registrare l'intero spazio. Successivamente, somministrare per via intraperitoneale cinque idrossitriptofano a un topo.
Posizionare il mouse nella gabbia trasparente e avviare la registrazione per 30 minuti. Rivedi il video registrato a velocità 0,5x e conta manualmente le contrazioni della testa. Recupera le criosezioni del cervello del topo dalla scatola della diapositiva.
Lasciare i vetrini su salviette pulite a temperatura ambiente fino a quando i campioni non si disidratano completamente. Utilizzare una penna bloccante liquido per disegnare un cerchio attorno al tessuto criosezionato. Quindi aggiungere la soluzione TBS-T.
Sul fondo di un vassoio, posizionare salviette inumidite per creare un ambiente umido per le diapositive. Dopo una permeablizzazione con TBS-T, aggiungere il 4% di siero d'asina per bloccare e incubare a temperatura ambiente per un'ora. Risciacquare i vetrini una volta immergendoli in TBS-T per cinque minuti.
Quindi applicare 100 microlitri di anticorpi primari opportunamente diluiti e miscela dappy su ciascun vetrino. Coprire il vassoio e incubare a temperatura ambiente durante la notte. Dopo l'incubazione, risciacquare con TBS-T tre volte per cinque minuti ciascuna.
Applicare 100 microlitri di specie opportunamente diluite abbinate a anticorpi secondari fluorescenti e incubare a temperatura ambiente per un'ora. Risciacquare con TBS-T tre volte per cinque minuti ciascuna, montare le guide con il mezzo di montaggio e coprire le diapositive con i vetrini di copertura. Dopo il montaggio, visualizzare il campione al microscopio a fluorescenza.
Il sistema PHM è stato regolato per produrre picchi di accelerazione verticale a circa 1,0 volte G che era equivalente a quelli delle teste dei ratti durante la corsa sul tapis roulant. L'applicazione di PHM ai topi ha attenuato significativamente la loro risposta di contrazione della testa rispetto ai topi di controllo che rappresentano un effetto soppressivo del PHM sulla segnalazione del recettore 5-HT2A nei neuroni della corteccia prefrontale. L'esecuzione del tapis roulant in PHM ha migliorato significativamente l'internalizzazione del recettore 5-HT2A e i neuroni della corteccia prefrontale del topo.
La quantificazione delle aree positive del recettore 5-HT2A internalizzate e associate alla membrana rispetto all'area nuova e positiva ha confermato questa osservazione. L'immunocolorazione e la quantificazione dell'espressione di c-Fos nei neuroni positivi al recettore 5-HT2A hanno mostrato che il tapis roulant in esecuzione in PHM ha downregolato l'espressione di c-Fos indotta da 5-HTP. Questo è l'evento cellulare a valle dell'attivazione del recettore 5-HT2A e dei neuroni PFC del topo.
L'intervento meccanico può essere applicato alle parti del corpo diverse dalla testa per studiare gli aspetti meccanici degli effetti dell'esercizio.
