Этот протокол описывает простой поведенческий анализ, который позволяет изучать неблагоприятное ассоциативное обучение и консолидацию памяти у мух, включая эффекты взаимодействия генной среды. Анализ, представленный здесь, представляет собой простую, воспроизводимую и экономически эффективную процедуру изучения механизмов памяти, которая может быть легко собрана с помощью нескольких доступных расходных материалов. Этот анализ может дать представление об основных механизмах, лежащих в основе нарушений обучения и памяти в результате различных генетических, фармакологических и диетических манипуляций.
Продемонстрировать эту процедуру будут Морган Теддер и Стивен Брэдли, студенты бакалавриата из моей лаборатории. Для начала просверлите четырехмиллиметровое отверстие перпендикулярно примерно четырем миллиметрам от дна в 14-миллилитровой полипропиленовой культуральной трубке. Снимите верхнюю часть культуральной трубки, чтобы сделать 45-миллиметровый нижний фрагмент, используемый в качестве нижнего отсека.
Отрежьте верхнюю часть наконечника пипетки объемом 1000 микролитров, чтобы создать 12-миллиметровый фрагмент. Вставьте фрагмент в четырехмиллиметровое отверстие культуральной трубки в качестве погрузочной док-станции для переноса мух. Вырежьте 15-миллиметровый кусок прозрачной виниловой трубки и вставьте нижний и верхний отсек с противоположных концов в трубку.
Прикрепите узел вертикально с помощью двухконтактного регулируемого зажима. Расположите верхний отсек вертикально, прикрепленный ударными трубками. Соедините ударные трубки с электрическим стимулятором для создания электрических ударов.
Используя ледяную холодную глыбу, обездвижите трех-четырехдневных мух и переложите их в отдельные флаконы с пищей за 24 часа до эксперимента. Присвойте код всем флаконам, как описано в тексте рукописи. Осторожно всасывайте одну муху в рот аспиратора, втягивая воздух.
Положите муху, слегка продув в погрузочный док и сразу же запустите минутный таймер и секундомер. Включите стимулятор и нанесите удар электрическим током, когда муха войдет в ударную трубку. Нажмите секундомер, чтобы записать первую задержку.
Если муха возвращается в ударную трубку, доставьте дополнительные удары. Используя счетчик или счетчик на основе Arduino, запишите количество ударов в течение одной минуты испытания. Осторожно перенесите муху обратно во флакон в конце одноминутного испытания.
Запишите задержку, количество полученных ударов и любые заметные изменения в поведении. Используя 70% этанол, очистите нижний и ударный отсек. Протрите безворсовой чистящей салфеткой и высушите ее с помощью фена.
Повторите пробную версию со следующей мухой. Очистите нижний отсек водой и моющим средством без запаха после завершения эксперимента. Используя 70% этанол, протрите нижний и ударный отсек и высушите воздух в течение ночи.
Повторив вышеуказанный процесс через 24 часа, выполните второе испытание. В аналогичной последовательности протестируйте мух. После выполнения пассивного анализа избегания у самцов мух Drosophila melanogaster результаты показали, что латентность увеличивается, количество ударов уменьшается, демонстрируя, что мухи узнали связь между верхним отсеком и электрическим ударом.
Распределение частот показало, что большинство мух проникают в верхний отсек и получают от одного до трех ударов в первом испытании. К четвертому испытанию большинство мух не заходят в верхний отсек и не получают никаких ударов. В последующих экспериментах продолжительность испытания была сокращена до одной минуты, поскольку частотное распределение по задержкам ясно показало, что если муха не входит в верхний отсек в течение 60 секунд в первом испытании, она обычно не входит вообще.
Эксперименты по пассивному избеганию были повторены у самцов и самок Drosophila simulans. Результаты показали, что мухи были эффективны в обучении пассивному поведению избегания, о чем свидетельствуют изменения в частотных распределениях для задержек и шоков у самцов и самок мух. Сравнение латентности и количества шоков между мужчинами и женщинами не выявило каких-либо статистически значимых различий.
Тем не менее, самки мух получали немного больше ударов в каждом испытании. Анализ схваток груминга во втором и третьем испытаниях показал, что общая продолжительность груминга значительно уменьшается у самок мух от первого испытания до три испытания. Это говорит о том, что мухи испытывают поведенческий стресс, который аналогичен тревожному поведению грызунов.
Сравнение влияния западной диеты и полетных упражнений на пассивное избегание поведения показывает, что западная диета уменьшает латентность и увеличивает количество шоков, указывающих на то, что западная диета ухудшает аверсивное ассоциативное обучение у мух. И наоборот, полетные упражнения смягчили негативное влияние западной диеты. При попытке этой процедуры помните, чтобы не напрягать мух.
Стрессовые мухи либо войдут в верхний отсек слишком быстро, либо не войдут вообще. Все эксперименты должны проводиться в одинаковых условиях окружающей среды и в одно и то же время суток. Этот метод дает исследователям новый простой анализ, который можно использовать для анализа внутренних механизмов обучения и консолидации памяти у мух.
