Этот протокол описывает ряд методов в рамках непрерывного рабочего процесса, которые могут быть использованы для оценки эффектов in vivo потенциальных регуляторов метастазирования меланомы, а также метастазирования других солидных злокачественных новообразований. Основным преимуществом нашего систематического рабочего процесса является повышенная воспроизводимость данных благодаря надежным и стандартизированным моделям и методам in vivo. Этот конвейер предлагает путь для обнаружения целей и разработки терапии путем тестирования кандидатов, выведенных из данных Omics или анализов in vitro в условиях in vivo.
Кривая обучения, связанная с методами, представленными в этом протоколе, сокращается за счет использования предоставленных материалов и следования подробному описанию при выполнении шагов. В демонстрации процедуры будут помогать Орландо Аристизабаль, научный сотрудник The Preclinical Imaging Core, и Ран Мубарак, инструктор в моей лаборатории. Для внутрикожных инъекций обезболивайте и брейте восьми-10-недельную мышь в шкафу биобезопасности, сохраняя при этом асептические условия.
Затем схватите и втягивайте кожу назад против траектории удара иглой и, используя шестимиллиметровую иглу инсулинового шприца 31 калибра, осторожно проколите кожу под острым углом со скосом, обращенным вверх. Вводите 30 микролитров суспензии опухолевой клетки медленно, пока не будет замечено куполообразное колесо. Мониторинг прогрессирования роста опухоли, потери веса и общего состояния здоровья.
Во время этих сеансов мониторинга проводите измерения с помощью суппортов и используйте размеры длины и ширины опухоли для расчета объема. Для внутрисердечных инъекций перенесите обезболенную мышь на нагретую платформу ультразвукового аппарата. Затем с помощью гипоаллергенной ленты прикрепите мышь к носовому конусу.
Побрить грудную клетку прямым лезвием бритвы или лезвием скальпеля, наклоненным под углом 30 градусов и очистить кожу вокруг процедурной зоны 10% повидон-йодом. Затем поместите ультразвуковой зонд в середину грудной клетки с левой стороны мыши, чтобы захватить горизонтальное окно, ориентированное на получение поперечного обзора левого желудочка. Когда длинная ось зонда обращена вверх, зафиксируйте зонд под углом 50 градусов, а нагретую платформу под углом 20 градусов, затем зафиксируйте зонд и опорную раму в нужном положении.
Во время работы внутри шкафа безопасности вытяните клеточную суспензию в туберкулиновый один миллилитровый шприц с 30 калибром однодюймовой иглой. Удалите пузырьки воздуха, присутствующие в шприце. Зафиксируйте шприц в стереотаксическом инжекторе.
А затем под ультразвуковым контролем продвиньте иглу через грудную стенку в левый желудочек сердца и медленно введите от 100 до 250 микролитров суспензии опухолевой клетки. Для поэтапной операции по выживанию поместите анестезированную мышь на согревающую прокладку и очистите кожу вокруг области процедуры 10% раствором повидона йода. Надев стерильные средства индивидуальной защиты и перчатки, наложите стерильную драпировку на тело животного.
Далее, используя ножницы Iris или скальпель, разрезают кожу, сохраняя пяти-семимиллиметровый резекционный край от края опухоли. При внутрикожных опухолях резецируют опухоль вместе с окружной кожей. При подкожных опухолях рассекают и удаляют опухоль под кожей.
После резекции опухоли закройте рану девятимиллиметровым сшивающим устройством. Для визуализации in vivo вводят субстрат d-люциферина мыши путем внутрибрюшинной инъекции с помощью одного миллилитра инсулинового шприца и иглы 28 калибра, затем обезболивают мышь и помещают ее в носовой конус внутри сканера биолюминесцентной визуализации. Запустите инструмент, нажав кнопку инициализировать и установив время экспозиции на auto.
Чтобы захватить пустое изображение для вычитания фона, нажмите кнопку «Получить» и сохраните изображение после завершения последовательности получения. Для анализа данных и того же программного обеспечения для обработки изображений in vivo перейдите в папку, в которой сохранены изображения, и откройте изображения всех мышей из одного эксперимента. Установите единицы измерения на излучение и убедитесь, что флажок, указывающий на человека, не установлен, так как это предотвратит нормализацию сигнала между группами.
Затем, используя интересующую область или инструмент рисования ROI, нарисуйте круговые ROI для области мозга и прямоугольные ROI для тела, исключите уши и нос в ROI мозга, поскольку они имеют тенденцию излучать неспецифическую яркость. Чтобы свести к минимуму смещение, нарисуйте ROI на фотографиях мышей без наложения люминесцентного сигнала, затем выберите показатель ROI для количественной оценки сигнала и экспорта данных в электронную таблицу. Анализируйте различия между группами, отображая общий люминесцентный поток в интересующих областях тела.
После окрашивания NuMA с помощью программного обеспечения нарисуйте ROI, чтобы включить все окрашенные NuMA клетки в ткань органа, за исключением других паренхим органов и пустых пространств. Настройте параметры, чтобы классифицировать положительные и отрицательные клетки NuMA, используя соответствующие положительные и отрицательные элементы управления для каждого органа. Используйте установленный программный алгоритм для количественной оценки общего количества процентов NuMA-положительных клеток для каждого образца.
Изображения биолюминесценции, яркого поля, флуоресценции ex vivo и окрашивания гематоксилином и эозином иллюстрируют многосторонний подход к анализу влияния генов-кандидатов на метастазирование меланомы. Глушение фукозилтрансферазы нарушает метастатическую диссеминацию клеток меланомы. Окрашенные NuMA участки легких клеток меланомы, инфицированные контрольным вирусом Линда и супрессором метастазов, экспрессирующим вирус Линды, показаны здесь.
Клетки метастатической меланомы помечены зеленым цветом, а область органа разграничена зеленой штриховкой. Поддержание должного напряжения в коже при выполнении внутрикожных инъекций, избегание воздушной эмболии при подготовке шприцев и получение адекватных резекционных краев, которые не должны мешать передвижению животного или предрасполагать его к раневым осложнениям, помогают улучшить успешность и воспроизводимость. Дальнейшее использование мультиплексной визуализации для изучения иммунной фильтрации, секвенирования одноклеточной РНК для анализа экспрессии генов и пространственной транскриптомики может обеспечить дополнительные возможности для изучения внутриопухолевой гетерогенности.
Комбинация методов, описанных в этом протоколе, помогла нам определить новые регуляторы метастазирования меланомы в мозг, такие как роль меланомы, секретируемого бета-амилоида в подавлении нейровоспаления и стимулировании метастазирования в мозг.
