Высокоскоростной видеомикроскопический анализ является надежным инструментом для диагностики первой линии первичной цилиарной дискинезии. Эта техника относительно проста в выполнении, быстра, экономична, а в опытных руках еще очень надежный инструмент. И он применим для пациентов всех возрастных групп.
Видеомикроскопия также выявляет вторичную цилиарную функцию. Как, например, из-за бактериальных или вирусных инфекций. Но он в основном использовался для диагностики первичной цилиарной дискинезии.
Ученые используют этот метод также для визуализации внутриклеточных процессов или биологических функций в живых клетках. Помочь мне в этой процедуре будет г-жа Тина Перомаа, наш лаборант.
Перед сбором дыхательных эпителиальных клеток попросите больного тщательно высморкаться. Когда пациент будет готов, держите голову пациента неподвижной одной рукой и используйте межзубную щетку размером 0,6 миллиметра в другой руке, чтобы расчесать нижнюю носовую раковину ноздри, чтобы собрать достаточное количество полосок эпителиальных клеток. Опустите собранные клеточные полоски в 1,5-миллилитровую микроцентрифужную трубку, содержащую DMEM, питаемый клетками.
После закрытия крышки микроцентрифуги проведите трубку к источнику света и встряхните трубку, чтобы обнаружить собранные клеточные полоски и конгломераты. Позже поместите микроцентрифужные трубки с правильно закрытыми крышками в полистирольную коробку. Перед плотным закрытием коробки убедитесь, что трубки закреплены внутри коробки.
Затем добавьте холодный пакет в коробку, избегая замораживания образца. После извлечения микроцентрифужных трубок, содержащих образцы, из полистирольной коробки поместите одну трубку под капот нагревательного блока микроскопа, чтобы прогреть до 37 градусов цельсия для высокоскоростного анализа видеомикроскопии или HSVMA. Далее запустите камеру и программное обеспечение видеоблока на компьютере.
Используйте пипетку, чтобы взять небольшой образец и поместить две капли образца в кювету. Накройте кювет крышкой, прежде чем поместить ее под микроскоп. Используйте масляную иммерсионную линзу с 100-кратным увеличением и нанесите каплю погружного масла на поверхность оптики.
Приближаясь к дну тарелки с помощью линзы микроскопа, ищите кластеры клеток без эритроцитов и с низким содержанием слизи. После поиска репрезентативной области интереса, или ROI, сосредоточьтесь на одной группе бьющихся ресничек с наибольшими движениями ресничек и запишите видеоряд. Записывайте клетки с биением ресничек сбоку и сверху.
Репрезентативный анализ показывает нормальные движения ресничек, видимые сбоку и сверху. Образец первичной цилиарной дискинезии, или пациента с ПХД, с мутацией в гене DNAH11 продемонстрировал классический жесткий минимально движущийся паттерн цилиарного биения. При взгляде сбоку и выше.
У другого пациента с ПХД с той же мутацией наблюдалась другая гиперкинетическая, но неэффективная картина биющихся ресничек. Патологический паттерн цилиарного биения и частота цилиарного биения также наблюдались у пациента с рецидивирующими инфекциями верхних дыхательных путей. Если процедура чистки зубов проводилась строго, анализ HSVMA не мог быть выполнен, так как реснитчатые эпителиальные клетки были покрыты покрытием эритроцитов.
Наиболее важным шагом в процедуре является получение достаточного количества дыхательных клеток из щеток и сохранение этого материала хорошо сохранившимся для видеоанализа. Оставшийся материал может быть использован для выполнения электронной микроскопии или иммунофлоресцентной микроскопии для обнаружения возможных структурных дефектов в ресничках или для выявления дефектов и синтеза цилиарных белков.
