Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в терапии микроРНК почки, которая остается проблемой. Основное преимущество этого метода заключается в том, что он позволяет проводить терапию микроРНК, имитирующих почку, не вызывая интерферонового ответа или генетической нестабильности. Начните с растворения 10 микролитров PEI-NP в 90 микролитрах 5% раствора глюкозы в 1,5-миллилитровой микроцентрифужной пробирке.
Затем осторожно поверните трубку и вращайте вниз. Смешайте 50 микролитров искусственно синтезированных микроРНК, растворенных в 100 микромолях безнуклеазной воды, с 50 микромолярами 10%-ного раствора глюкозы в 1,5-миллилитровых микроцентрифужных пробирках. Осторожно поверните трубку и вращайте вниз.
Этот процесс дает микроРНК, растворенную в 5% растворе глюкозы. Затем смешайте 100 микролитров PEI-NP в 5% растворе глюкозы и 100 микролитров миРНК, имитирующей 5% раствор глюкозы. Осторожно поверните трубку и вращайте вниз.
Инкубируйте смесь в течение 15 минут при комнатной температуре, чтобы получить стабильный комплекс ПЭИ-НП, имитирующих микроРНК. Растворите два микролитра PEI-NP в 98 микролитрах 10% раствора глюкозы в микроцентрифужной пробирке объемом 1,5 миллилитра. Осторожно поверните трубку и вращайте вниз.
Затем добавьте 100 микролитров миРНК, меченной Cy3, к 100 микролитрам PEI-NP в 10% растворе глюкозы и осторожно поверните трубку. Инкубируйте смесь в течение 15 минут при комнатной температуре, чтобы получить стабильный комплекс PEI-NPs-Cy3-меченой миРНК-мимики. Поместите мышь UUO головой вперед в 50-миллилитровую центрифужную пробирку без анестезии, а затем поместите хвост через подготовленное отверстие в крышке.
Наполните шприц объемом один миллилитр иглой 30-го калибра 200 микролитрами мимического комплекса PEI-NPs-Cy3 и введите комплекс через хвостовую вену мыши. Затем сделайте разрез на коже, мышцах и ребрах хирургическими ножницами и щипцами, чтобы обнажить сердце. Сделав разрез в правом предсердии, вводите PBS в левый желудочек до тех пор, пока цвет почек не изменится на бледно-желтый.
Это указывает на то, что все тело мыши перфузировано PBS. После сбора почек удалите почечные капсулы и дважды промойте их PBS. Поместите образцы почечной ткани в соединение ОКТ и заморозьте их в жидком азоте.
Используйте криостат для подготовки секций и монтажа секций на предметные стекла с силановым покрытием. Закрепите их 4%-ным параформальдегидом и дважды аккуратно промойте предметные стекла PBS. Наконец, визуализируйте флуоресцентное окрашивание с помощью флуоресцентной микроскопии со 100-кратным и 400-кратным увеличением и соответствующим программным обеспечением для визуализации.
На репрезентативном изображении показана структура мимического комплекса PEI-NPs-miRNA. На этих изображениях изображена доставка и эффекты мимики miRNA-146a-5p-с с использованием PEI-NP при фиброзе почек. Анализ флуоресцентной микроскопии показал, что инъекция PEI-NP в хвостовую вену может доставить имитатор микроРНК в тубулоинтерстициальное пространство.
У мышей с фиброзом почек, продуцируемых UUO, это включало клетки почечных канальцев, которые не имеют регулярной формы в почках и клубочках. Анализ qRT-PCR показал, что инъекция PEI-NPs-miRNA-146a-5p-мимически индуцировала значительную сверхэкспрессию miRNA-146a-5p в почке. Здесь показан гистологический анализ с окрашиванием Сириуса в красный цвет.
Анализ флуоресцентной микроскопии показал, что инъекция PEI-NP в хвостовую вену может доставлять мимическую микроРНК в клубочек и тубулоинтерстициальное пространство в почках мышей с диабетической почками in vivo. Кроме того, анализ qRT-ПЦР показал, что инъекция PEI-NPs-miRNA-181b-5p-имитатора индуцировала значительную сверхэкспрессию miRNA-181b-5p в почках. Гистологический анализ с периодическим окрашиванием кислотой Шиффа показал, что инъекция PEI-NPs-miRNA-181b-5p-мимика один раз в неделю с 10 до 20-недельного возраста ингибировала прогрессирование диабетической болезни почек у мышей.
Здесь показаны доставка и эффекты имитации PEI-NPs-miRNA-5100 у мышей с острым повреждением почек, полученных при реперфузионном повреждении ишемии. На этих изображениях изображены данные анализа флуоресцентной микроскопии, анализа qRT-PCR для оценки эффектов сверхэкспрессии miRNA-5100 после инъекции PEI-NPs-miRNA-5100-mimic и гистологического анализа почки, окрашенной гематоксилин-эозином. PEI-NP, вводимые через хвостовую вену за два дня до процедуры ишемического реперфузионного повреждения, или IRI, предотвращают прогрессирование острого повреждения почек, вызванного IRI.
При выполнении этой техники подготовьте срезы толщиной пять микрометров, которые включают как можно больше почечной ткани. Также можно подготовить срезы толщиной семь микрометров.
