Протоколы культивирования собачьих печеночных и кишечных органоидов важны для стандартизации этой новой технологии. Этот метод позволяет надежно и воспроизводимо создавать органоидную культуру собак, включая выделение органоидов, поддержание, сбор и последующее биобанкование образцов. Органоиды собак могут обеспечить отличную модель для многочисленных применений, охватывающих биологию, развитие инфекционных заболеваний, тестирование и открытие лекарств, а также медицину передачи.
Для начала приготовьте пять 15-миллилитров центрифужных трубок с пятью миллилитрами 1X полного хелатирующего раствора, одну трубку с тремя миллилитрами 1X полного хелатирующего раствора, одну пустую трубку и одну трубку с пятью миллилитрами 1X полного хелатирующего раствора и двумя миллилитрами фетальной бычьей сыворотки. В день изоляции поместите в шкаф биобезопасности стерильную чашку Петри, скальпель, ведро со льдом и холодную питательную смесь DMEM F12. Поместите необходимое количество 24-луночной пластины для культивирования клеток в углекислый инкубатор для предварительного нагрева.
Поместите солюбилизированный внеклеточный мембранный матрикс на лед для оттаивания. Предварительно охладите центрифугу до четырех градусов Цельсия. Переместите полную среду с факторами роста из морозильной камеры на водяную баню 37 градусов цельсия, избегая прямого воздействия света.
Встряхните образцы тканей в транспортной трубке в течение 30 секунд. Удалите избыток супернатанта, не отбрасывая какую-либо ткань, путем медленного пипетирования вблизи поверхности жидкости до тех пор, пока в трубке не останется 0,5 миллилитра. Перенесите ткань и оставшийся супернатант в стерильную чашку Петри.
Используя одноразовый скальпель, разрежьте и измельчите ткань на более мелкие кусочки, напоминающие консистенцию пюре, в течение примерно пяти минут. Пипетка измельченной ткани жидкостью из чашки Петри в первую полную пробирку с хелатирующим раствором, затем добавьте два миллилитра усовершенствованной питательной смеси DMEM F12 в чашку Петри. Промыть оставшуюся ткань и перенести в первый полный хелатирующий раствор трубку.
Вихрь 1X полный хелатирующий раствор трубки примерно пять раз в течение пяти секунд. Дайте биопсии осесть на дне трубки в течение одной минуты и удалите супернатант до тех пор, пока не останется пять миллилитров. Перенесите 1X полный хелатирующий раствор из новой трубки в пробирку.
Повторите предыдущий шаг для следующих двух трубок. И на последних двух смывах удалите супернатант до трех миллилитров, оставшихся в трубке. Перенесите биопсию и 1X полный хелатирующий раствор из пробирки в одну лунку из шестилуночной пластины.
Добавьте три миллилитра 1X полного хелатирующего раствора в пробирку. Аккуратно закрутите, чтобы собрать оставшуюся ткань и перенести в тот же колодец пластины. Добавьте 150 микролитров 0,5 молярной тетрауксусной кислоты этилендиамина в лунку и поместите шестилуночную пластину на коромысл 20 градусов 24 об/мин при четырех градусах Цельсия.
Инкубируйте образцы печени в течение 10 минут и образцы кишечника в течение одного часа на движущейся коромысле. Транспортируйте шестилуночную пластину обратно в шкаф биобезопасности и перенесите измельченную ткань и жидкость в трубку, содержащую 1X полный хелатирующий раствор с фетальной бычьей сывороткой. Дайте тканям осесть и транспортировать супернатант с 0,2 миллилитрами верхней части ткани в пустую трубку.
Вращайте трубку, содержащую образец, при 700 XG в течение пяти минут при четырех градусах Цельсия. Стволовые клетки теперь гранулируются вместе с измельченной тканью. Осторожно удалите и выбросьте супернатант, чтобы не потревожить гранулу.
Повторное суспендирование гранул в усовершенствованном DMEM F12. Снова раскрутите трубку и аспирируйте супернатант, не нарушая гранулу. Добавьте расчетный объем солюбилизированного внеклеточного мембранного матрикса в пробирку.
Будьте осторожны при удалении среды, чтобы не потерять ячейку гранулы. При добавлении внеклеточного мембранного матрикса пипетка медленно не создает избыточных пузырьков в органоидной суспензии. Держите образец с солюбилизированным внеклеточным мембранным матриксом на льду и засевайте суспензию в середине лунок так, чтобы солюбилизированный внеклеточный мембранный матрикс образовывал куполообразную структуру.
Транспортируйте пластину в инкубатор и дайте солюбилизированному внеклеточному мембранному матриксу затвердеть в течение 30 минут. Смешайте ингибитор ROCK и бета GSK3 в полной среде с факторами роста и добавьте 500 микролитров этого раствора в каждую лунку. Поместите тарелку в инкубатор.
Протокол органоидов собак обычно генерирует приблизительно от 50 000 до 150 000 клеток кишечника или печени на лунку. После выделения стволовых клеток печеночные собачьи органоиды начинают свой жизненный цикл как расширяющиеся сфероиды, а через семь дней превращаются в почковые и дифференцирующие органоиды. Были рассчитаны объем, площадь поверхности, площадь 2D-эллипса и окружность сфероидов.
Площадь и окружность эллипса 2D использовались для оценки здоровья органоидной культуры. Оценка экспрессии маркеров полуколичественным способом показала, что сфероиды преимущественно экспрессировали холангиоцитарный маркер KRT7 в диапазоне от одного до 26%Экспрессия маркера стволовых клеток LGR5 варьировалась от 0,17 до 0,78%, в то время как маркеры гепатоцитов экспрессировались в меньшей степени на 0,05-0,34% для Forkhead box 1A и от 0,03 до 0,28% для цитохрома-P450. 12-минутная инкубация с трипсин-подобной протеазой не ингибировала рост органоидов.
Однако на рост органоидов негативно повлияли с помощью 24-минутной инкубации. Проанализирована живучесть собачьих печеночных органоидов в неблагоприятной среде для определения объема органоидных сред и фундаментного матрикса, необходимого для успешного роста и выживания печеночных органоидов. Выживаемость органоидов варьировалась от 12,9 дней до 18 дней.
Основные методы культивирования клеток и асептические подходы являются необходимыми предпосылками для правильной изоляции и поддержания органоидов.
