В настоящее время мы имеем ограниченное представление о биологии плазмодийной инфекции печени. Этот протокол помог нам создать множество трансгенных линий, которые помогли ответить на некоторые важные вопросы о биологии организма. Фундаментальное понимание паразита и его биологии требуется для разработки новых инструментов и подходов к борьбе с малярией.
Метод трансгенеза, который мы здесь описываем, помог нам расшифровать некоторые ключевые и сложные биологические особенности как организма, так и хозяина. Эту процедуру будет демонстрировать Карсон Бауэрс, руководитель моей лаборатории. После получения инфицированных P.Bergehei мышей и их эвтаназии собирают два миллилитра крови двух инфицированных мышей в пять миллилитров раствора Elsevier в стерильной среде.
Центрифугируйте кровь при 450 г в течение восьми минут при комнатной температуре. Выбросьте надосадочную жидкость и повторно суспендируйте клеточную гранулу в 10 миллилитрах полной среды RPMI. Снова центрифугируйте клеточную суспензию и повторно суспендируйте гранулу в 25 миллилитрах полной среды RPMI.
Переложите клеточную суспензию в культуральную колбу Т75 с крышкой фильтра и инкубируйте при легком встряхивании, чтобы клетки оставались во взвешенном состоянии. По окончании инкубации соберите 500 микролитров пробы. Центрифугируйте и повторно суспендируйте гранулы в 10 микролитрах полной среды RPMI.
Далее приготовьте тонкий мазок крови. Окрасьте мазок крови краской Гимзы и определите частоту шизонтов. Для оптимальной эффективности трансфекции от 60 до 70% паразитов должны находиться в стадии шизонта.
Приготовьте градиентный центрифугирующий буфер, восстановив 13 миллилитров исходной среды с градиентом плотности в 50-миллилитровой центрифугированной пробирке. Переложите 25 миллилитров культуры крови в свежую центрифугированную пробирку объемом 50 миллилитров. Затем аккуратно нанесите 20 миллилитров градиентного центрифугированного буфера на дно центрифугированной пробирки, используя узкую стеклянную пипетку, чтобы создать градиентный столбик и обеспечить четкое разделение между буфером и средой.
Центрифугируют подготовленный буфер и среду в течение 20 минут при 450 G без перерыва при комнатной температуре. С помощью пастбищной пипетки осторожно удалите слой шизонта на границе раздела питательной среды и буфера градиентного центрифугирования. Поместите его в новую центрифугированную пробирку объемом 50 миллилитров.
Повторно суспендируйте изолированные шизонты в полной среде RPMI и увеличьте общий объем до 40 миллилитров. После центрифугирования и выброса надосадочной жидкости повторно суспендируйте шизонт в 10 миллилитрах полной среды RPMI. Затем переносят один миллилитр этого раствора в микроцентрифужную пробирку объемом 1,5 миллилитра для каждой трансфекции и гранулируют инфицированные клетки центрифугированием при 16 000 G в течение пяти секунд.
Затем соедините 100 микролитров электропорационного буфера при комнатной температуре с пятью микрограммами целевой плазмидной ДНК в пробирке микроцентрифуги объемом 1,5 миллилитра. После центрифугирования инфицированных клеток удалите надосадочную жидкость и осторожно повторно суспендируйте клетки в приготовленном растворе нуклеофектора плюс плазмидную ДНК. Затем переведите суспензию в электропорацию, кюветы и трансфицируйте с помощью подходящей программы нуклеофектора.
Затем добавьте в кювету 100 микролитров полной среды RPMI. Перелейте весь раствор в микроцентрифужную пробирку объемом 1,5 миллилитра и поместите ее на лед. Проверяйте уровень паразитемии у мышей, привитых трансфицированным шизонтом, ежедневно, начиная с двух дней после инокуляции.
Как только инфекция подтвердится, начните выбор препарата, вводя препарат перорально и выпивая воду, предлагаемую вволю. Контролируйте паразитемию с помощью мазков крови, начиная с шести дней после начала лечения пирометимином. Когда паразитемия достигает хотя бы 1%, переносите паразитов на наивных мышей B6 для создания запасов паразитов на стадии крови.
Как только паразитемия достигает 2-5%, генерируют запасы и криоконсервируют их. За день до заражения комарами отделите самок комаров, положив перчатку, наполненную водой, нагретой до 37 градусов Цельсия, на клетку, содержащую как самцов, так и самок комаров. Используйте аспиратор от насекомых, чтобы удалить самок комаров, привлеченных источником тепла, и переместить их в клетку меньшего размера для заражения.
В день кормления комаров и заражения определите паразитемию у инфицированных мышей В6. Паразитемия от 2% до 5% оптимальна для заражения комарами. После проверки паразитемии передайте инфекцию самкам комаров, поместив мышей под наркозом на самок комаров в клетке под грудным лежачьим положением.
Вручную раздвиньте передние и задние лапы, чтобы обеспечить наибольшую площадь поверхности для кормления комаров. Оставьте зараженных мышей в каждой клетке на 15 минут, проверяя каждые пять минут, чтобы убедиться, что мыши не проснулись. Как только кормление будет завершено и мыши будут усыплены, безопасно утилизируйте их, следуя рекомендациям учреждения.
Чтобы убедиться в успешном заражении комаров, изолируйте среднюю кишку комаров, удалив терминальный сегмент брюшка щипцами через 10 дней после заражения. Затем осмотрите среднюю кишку под поляризованным светом, чтобы обнаружить наличие ооцист. Через 18 дней после заражения препарируют от 5 до 10 комаров, чтобы оценить количество присутствующих спорозоитов.
Чтобы выделить и подсчитать спорозоиты, осторожно удалите голову комара, одновременно надавливая на грудную клетку щипцами или тонкой рассекающей иглой. Слюнные железы останутся прикрепленными к удаленной головке. Затем удалите все дополнительные остатки комаров из слюнных желез и поместите их в микроцентрифужную пробирку, содержащую 400 микролитров среды для препарирования комаров.
Затем нарушите изолированные слюнные железы, пропустив их через игольчатый шприц 30-го калибра 15-20 раз, После этого поместите 10 микролитров разрушенных слюнных желез в среду для препарирования комаров в гемоцитометр и подсчитывайте. Наконец, повторно суспендируйте слюнные железы в желаемой концентрации среды для диссекции комаров или PBS для инъекции мышам или длительного криоконсервирования. Как и микроскопические изображения, изображающие зрелые и неполовозрелые P.berghei schizont в культурах крови паразитированных мышей.
Например, микроскопические изображения головы комара со слюнными железами, оставшимися нетронутыми во время вскрытия, и рассеченной слюнной железы при меньшем и большем увеличении. Генерация зеленого флуоресцентного сигнала в клетках-хозяевах, инфицированных HEPA GFP 11, указывала на лизис паразитофорной вакуоли. Важно аккуратно удалить слой шессона, не нарушая интерфейс градиента.
Кроме того, требуется немного практики, чтобы надежно удалить слюнные железы вместе с головой во время легкого выделения спор. После выделения трансгенные спорозоиты могут быть криоконсервированы или использованы в свежем виде для исследований инфекции in vivo или in vitro.
