Этот метод генерирует кардиолипиновую отпечатку пальцев лейкоцитов методом масс-спектрометрии MALDI-TOF и позволяет измерять соотношение между монолизокардиолипином и кардиолипином для быстрой диагностики синдрома Барта. Основным преимуществом данной методики является обнаружение диагностических липидных видов путем однократного раунда масс-спектрометрии сразу после выделения лейкоцитов из одного миллилитра крови. Это, а также чувствительность и специфичность глаз делают этот анализ подходящим диагностическим тестом для интеграции в рутинную работу клинических лабораторий по скринингу синдрома Барта.
Начните с размещения образцов крови на орбитальном шейкере в течение 10 минут. Далее к 0,9 миллилитра цельной крови в 1,5 миллилитра пробирки добавляют 0,1 миллилитра 20%-го декстрана. Теперь пипетку и рассейте суспензию осторожно 20 раз, избегая пузырьков воздуха и дайте эритроцитам отстояться около одного часа при комнатной температуре.
Используя шприц, соберите и переложите желтый супернатант в 15-миллилитровую трубку, а затем центрифугу в 400 раз больше G в течение 15 минут при комнатной температуре. После выброса супернатанта повторно суспендируют гранулы, содержащие в основном лейкоциты и остаточные эритроциты, в 0,6 миллилитра ледяной холодной двойной дистиллированной воды. Примерно через 15 секунд добавьте 0,2 миллилитра 0,6 молярного хлорида калия в клеточную суспензию, чтобы восстановить правильную осмолярность.
Короткий осмотический шок лизирует эритроциты и оставляет лейкоциты нетронутыми. Затем отрегулируйте конечный объем до 2,5 миллилитров с однократной прочностью PBS. Далее центрифугируют суспензию в 400 раз G в течение 15 минут при комнатной температуре.
За этим следует отбрасывание супернатанта и повторное промывание гранулы лейкоцитов 2,5 миллилитрами однократной прочности PBS. Повторите центрифугу и выбросьте супернатант, как описано ранее, и повторно суспендируйте гранулу, содержащую лейкоциты, в 200 микролитрах стерилизованной двойной дистиллированной воды. Заморозьте суспензию при минус 80 градусах Цельсия или непосредственно выполните экстракцию липидов.
Начните экстракцию, перенеся 20 микролитров суспензии лейкоцитов в трубку объемом 1,5 миллилитра и вращайтесь при 16 000 g в течение 30 секунд. После выброса супернатанта добавьте 10 микролитров хлороформа к оставшейся грануле и многократно пипетку, чтобы способствовать экстракции липидов. Теперь добавьте 10 микролитров 9-аминоакридинового матричного раствора в гранулу в хлороформе.
Пипетку и разогнать многократно, чтобы перемешать. Раскрутите раствор, содержащий липиды и хлороформ, а также 9-аминоакридиновый матричный раствор в 16 000 раз в G в течение 30 секунд. Наконец, нанесите супернатант в виде капель по 0,35 микролитра на мишень MALDI, подлежащую анализу, и дайте каплям высохнуть на воздухе, по крайней мере, в течение 10-15 минут.
Для анализа липидов получите масс-спектры образцов в трех экземплярах на масс-спектрометре MALDI-TOF. После калибровки с помощью липидных эталонов установите анализы в режим отрицательных ионов и оптимизируйте диапазон соотношения массы к заряду детектирования от 200 томсона до 2000 томсонов для анализа малых молекул. Держите флюенс лазера на 5% выше порога, чтобы иметь хорошее отношение сигнал/шум.
Для каждого массового спектра применяйте в среднем 2000 одиночных лазерных снимков. Получение спектра в режиме рефлектора с помощью замедленной импульсной экстракции. Нанесите закрытую матричную подвеску на 400 thomson для предотвращения насыщения детектора.
На рисунке показано, что дефекты гена TAFAZZIN обычно определяют липидный профиль, специфичный для синдрома Барта, о чем свидетельствует появление монолизокардиолипина и незрелых форм кардиолипина вместе с уменьшением зрелых форм кардиолипина в отпечатке кардиолипина. Кроме того, рисунок также показывает, что maldi-TOF / MS анализ лейкоцитов контрольных субъектов обычно демонстрирует только два вида зрелого кардиолипина. Рисунок показывает, что монолизокардиолипин плюс незрелый кардиолипин по соотношению зрелых кардиолипинов у пациентов с синдромом Барта был выше, чем у здоровых субъектов и пациентов с сердечной недостаточностью.
Здесь контрольные группы и пациенты с синдромом Барта разделены более чем на один порядок, показывая, что этот метод обладает сильной диагностической способностью для синдрома Барта. Чтобы обеспечить хороший результат анализа, важно тщательно соблюдать все этапы протокола от выделения лейкоцитов до расчета соотношения монолизокардиолипина к кардиолипину. Масс-спектрометрия MALDI-TOF полезна для получения липидных профилей небольших количеств различных биологических образцов для выявления липидных биомаркеров или патологических изменений.
