Questo metodo genera un'impronta digitale cardiolipina dei leucociti mediante spettrometria di massa MALDI-TOF e consente la misurazione del rapporto tra monolisocardiolipina e cardiolipina per una diagnosi rapida della sindrome di Barth. Il principale vantaggio di questa tecnica è il rilevamento di specie lipidiche diagnostiche mediante un singolo ciclo di spettrometria di massa immediatamente dopo l'isolamento dei leucociti da un millilitro di sangue. Questi e la sensibilità e specificità oculare rendono questo test un test diagnostico adatto da integrare nel lavoro di routine dei laboratori clinici per lo screening della sindrome di Barth.
Inizia posizionando campioni di sangue su uno shaker orbitale per 10 minuti. Successivamente, a 0,9 millilitri di sangue intero in un tubo da 1,5 millilitri, aggiungere 0,1 millilitri del 20% destro. Ora pipettare e disperdere delicatamente la sospensione 20 volte evitando bolle d'aria e lasciare sedimentare i globuli rossi per circa un'ora a temperatura ambiente.
Utilizzando una siringa, raccogliere e trasferire il surnatante giallo in un tubo da 15 millilitri e quindi centrifugare a 400 volte G per 15 minuti a temperatura ambiente. Dopo aver scartato il surnatante, risospese il pellet contenente principalmente leucociti e globuli rossi residui in 0,6 millilitri di acqua ghiacciata a doppia distillazione. Dopo circa 15 secondi, aggiungere 0,2 millilitri di cloruro di potassio molare 0,6 alla sospensione cellulare per ripristinare la corretta osmolarità.
Il breve shock osmotico farà lisare i globuli rossi e lascerà intatti i leucociti. Quindi regolare il volume finale a 2,5 millilitri con PBS a singola resistenza. Quindi, centrifugare la sospensione a 400 volte G per 15 minuti a temperatura ambiente.
Questo è seguito dallo scarto del surnatante e dal rilavaggio del pellet leucocitario con 2,5 millilitri di PBS a singolo dosaggio. Ripetere la centrifuga ed eliminare il surnatante come descritto in precedenza e risospescere il pellet contenente leucociti in 200 microlitri di acqua doppia distillata sterilizzata. Congelare la sospensione a meno 80 gradi Celsius o eseguire direttamente l'estrazione lipidica.
Avviare l'estrazione trasferendo 20 microlitri di sospensione leucocitaria in un tubo da 1,5 millilitri e ruotare a 16.000 volte G per 30 secondi. Dopo aver scartato il surnatante, aggiungere 10 microlitri di cloroformio al pellet rimanente e pipettare ripetutamente per favorire l'estrazione dei lipidi. Ora, aggiungere 10 microlitri di soluzione di matrice 9-aminoacridina al pellet in cloroformio.
Pipettare e disperdere ripetutamente per mescolare. Ruotare la soluzione contenente lipidi e cloroformio e soluzione di matrice 9-aminoacridina a 16.000 volte G per 30 secondi. Infine, depositare il surnatante come goccioline di 0,35 microlitri sul target MALDI da analizzare e lasciare asciugare le goccioline all'aria almeno per 10-15 minuti.
Per l'analisi lipidica, acquisire spettri di massa di campioni in triplicati su uno spettrometro di massa MALDI-TOF. Dopo la calibrazione con gli standard lipidici, impostare le analisi in modalità ione negativo e ottimizzare l'intervallo massa-carica di rilevamento da 200 thomson a 2.000 thomson per l'analisi di piccole molecole. Mantenere la fluenza del laser del 5% al di sopra della soglia per avere un buon rapporto segnale-rumore.
Per ogni spettro di massa, applicare una media di 2.000 colpi laser singoli. Acquisire lo spettro in modalità riflettore utilizzando l'estrazione pulsata ritardata. Applicare la sospensione a matrice gated a 400 thomson per evitare la saturazione del rilevatore.
La figura mostra che i difetti del gene TAFAZZIN determinano tipicamente un profilo lipidico specifico della sindrome di Barth indicato dalla comparsa di monolisocardiolipina e forme di cardiolipina immatura insieme alla riduzione delle forme mature di cardiolipina nell'impronta digitale della cardiolipina. Inoltre, la figura mostra anche che le analisi MALDI-TOF / MS dei leucociti dei soggetti di controllo in genere mostrano solo due specie di cardiolipina matura. La figura mostra che la monolisocardiolipina più cardiolipina immatura sul rapporto di cardiolipina matura per i pazienti con sindrome di Barth era superiore a quella dei soggetti sani e dei pazienti con insufficienza cardiaca.
Qui, i gruppi di controllo e i pazienti con sindrome di Barth sono separati da più di un ordine di grandezza, dimostrando che questo metodo ha una forte capacità diagnostica per la sindrome di Barth. Per garantire un buon risultato del test, è fondamentale seguire attentamente tutte le fasi del protocollo dall'isolamento dei leucociti al calcolo del rapporto monolysocardiolipin-to-cardiolipin. La spettrometria di massa MALDI-TOF è utile per ottenere profili lipidici di piccole quantità di vari campioni biologici per identificare biomarcatori lipidici o alterazioni patologiche.
