이 방법은 MALDI-TOF 질량 분광법에 의해 백혈구의 카디오리핀 핑거 프린팅을 생성하고 Barth 증후군의 신속한 진단을 위해 모노리소카디오리핀과 카디오리핀 사이의 비율을 측정 할 수있게합니다. 이 기술의 가장 큰 장점은 한 밀리리터의 혈액에서 백혈구를 분리 한 직후에 단일 질량 분광법에 의한 진단 지질 종의 검출입니다. 이들 및 안구 민감도 및 특이성은 이 검정을 Barth 증후군을 스크리닝하기 위해 임상 실험실의 일상적인 작업에 통합하기에 적합한 진단 시험으로 만든다.
혈액 샘플을 궤도 쉐이커에 10 분 동안 올려 놓음으로써 시작하십시오. 다음으로, 1.5 밀리리터 튜브에 전혈 0.9 밀리리터에 0.1 밀리리터의 20 % 덱스트란을 첨가하십시오. 이제 피펫을 하고 기포를 피하면서 서스펜션을 20배 부드럽게 분산시키고 RBCs를 실온에서 약 한 시간 동안 침전시킨다.
주사기를 사용하여, 황색 상청액을 수집하고 15 밀리리터 튜브로 옮긴 다음, 실온에서 15분 동안 400배 G에서 원심분리한다. 상청액을 버린 후, 주로 백혈구 및 잔류 RBC를 함유하는 펠렛을 0.6 밀리리터의 얼음 차가운 이중 증류수에 재현탁시킨다. 약 15초 후, 0.2밀리리터의 0.6몰 염화칼륨을 세포 현탁액에 첨가하여 정확한 삼투압을 회복시킨다.
짧은 삼투압 쇼크는 RBC를 용해시키고 백혈구를 그대로 유지합니다. 그런 다음 단일 강도 PBS로 최종 부피를 2.5 밀리리터로 조정하십시오. 다음에, 현탁액을 실온에서 15분 동안 400배 G에서 원심분리한다.
이어서 상청액을 버리고 백혈구 펠렛을 2.5 밀리리터의 단일 강도 PBS로 재세척하였다. 원심분리를 반복하고 앞서 기술한 바와 같이 상층액을 버리고, 백혈구를 함유하는 펠렛을 멸균된 이중 증류수 200 마이크로리터에 재현탁시킨다. 현탁액을 섭씨 영하 80도에서 동결하거나 지질 추출을 직접 수행하십시오.
20 마이크로리터의 백혈구 현탁액을 1.5 밀리리터 튜브로 옮기고 16, 000 배 G에서 30 초 동안 회전시켜 추출을 시작하십시오. 상청액을 버린 후 나머지 펠렛에 클로로포름 10 마이크로 리터를 넣고 지질 추출을 촉진하기 위해 반복적으로 피펫을 반복하십시오. 이제 10 마이크로 리터의 9- 아미노 아크리딘 매트릭스 용액을 클로로포름의 펠렛에 첨가하십시오.
피펫과 혼합을 위해 반복적으로 분산시킨다. 지질 및 클로로포름 및 9-아미노아크리딘 매트릭스 용액을 함유하는 용액을 16, 000배 G에서 30초 동안 스핀핑한다. 마지막으로, 분석하고자 하는 MALDI 타겟 상에 0.35 마이크로리터의 액적으로서 상청액을 침착시키고, 액적들을 적어도 10 내지 15분 동안 공기 건조시킨다.
지질 분석을 위해, MALDI-TOF 질량 분광계에서 삼중으로 샘플의 질량 스펙트럼을 획득하십시오. 지질 표준으로 보정한 후 음이온 모드에서 분석을 설정하고 소분자 분석을 위해 200 톰슨에서 2, 000 톰슨까지 검출 질량 대 전하 비율 범위를 최적화합니다. 레이저 플루언스를 임계값보다 5% 높게 유지하여 신호 대 잡음비가 양호하도록 합니다.
각 질량 스펙트럼에 대해 평균 2, 000개의 단일 레이저 샷을 적용합니다. 지연된 펄스 추출을 사용하여 반사기 모드에서 스펙트럼을 획득합니다. 검출기 포화를 방지하기 위해 400 톰슨에 게이트 매트릭스 현탁액을 적용하십시오.
도면은 TAFAZZIN 유전자의 결함이 전형적으로 카디오리핀 지문에서 성숙한 카디오리핀 형태의 감소와 함께 모노리소카디오리핀 및 미성숙 카디오리핀 형태의 출현에 의해 나타나는 바르트 증후군에 특이적인 지질 프로파일을 결정한다는 것을 보여준다. 또한, 이 수치는 또한 대조군 피험자의 백혈구에 대한 MALDI-TOF/MS 분석이 일반적으로 두 종의 성숙한 카디오리핀만을 나타낸다는 것을 보여준다. 이 수치는 Barth 증후군 환자의 성숙한 카디오리핀 비율에 대한 모노 리카디오리핀과 미성숙 카디오리핀이 건강한 피험자 및 심부전 환자보다 높았다는 것을 보여줍니다.
여기서, 대조군과 바르트 증후군 환자는 하나 이상의 규모로 분리되며, 이 방법이 바르트 증후군에 대한 강력한 진단 능력을 갖는다는 것을 보여준다. 좋은 분석 결과를 보장하기 위해서는 백혈구 분리에서 모노리소카디오리핀 대 카디오리핀 비율 계산에 이르기까지 모든 프로토콜 단계를 신중하게 따르는 것이 중요합니다. MALDI-TOF 질량 분광법은 지질 바이오마커 또는 병리학적 변화를 확인하기 위해 소량의 다양한 생물학적 샘플의 지질 프로파일을 획득하는데 유용하다.
