この方法は、MALDI−TOF質量分析によって白血球のカルジオリピンフィンガープリントを生成し、バルト症候群の迅速な診断のためにモノリゾカルジオリピンとカルジオリピンとの間の比率の測定を可能にする。この技術の主な利点は、1ミリリットルの血液から白血球を単離した直後に、1回の質量分析による診断用脂質種の検出である。これらおよび眼の感度および特異性により、このアッセイは、バルト症候群をスクリーニングするための臨床検査室のルーチン作業に統合されるのに適した診断試験となる。
血液サンプルをオービタルシェーカーに10分間置くことから始めます。次に、1.5ミリリットルのチューブに0.9ミリリットルの全血に、0.1ミリリットルの20%デキストランを加える。今度はピペットで、気泡を避けながら懸濁液を穏やかに20回分散させ、室温で約1時間赤血球を沈降させる。
シリンジを用いて、黄色の上清を集めて15ミリリットルのチューブに移し、次いで室温で15分間、400倍Gで遠心分離する。上清を捨てた後、主に白血球および残留赤血球を含むペレットを0.6ミリリットルの氷冷二重蒸留水に再懸濁する。約15秒後、0.2ミリリットルの0.6モル塩化カリウムを細胞懸濁液に加え、正しい浸透圧を回復させた。
短い浸透圧ショックはRBCを溶解し、白血球をそのまま残します。その後、最終容量を単一強度PBSで2.5ミリリットルに調整します。次に、懸濁液を400倍Gで室温で15分間遠心分離する。
これに続いて、上清を捨て、白血球ペレットを2.5ミリリットルの単一強度PBSで再洗浄する。遠心分離を繰り返し、前述のように上清を捨て、白血球を含むペレットを200マイクロリットルの滅菌二重蒸留水に再懸濁する。懸濁液をマイナス80°Cで凍結するか、脂質抽出を直接行う。
20マイクロリットルの白血球懸濁液を1.5ミリリットルのチューブに移し、16,000倍のGで30秒間スピンすることによって抽出を開始する。上清を捨てた後、残りのペレットにクロロホルム10マイクロリットルを加え、ピペットを繰り返して脂質抽出を促進した。次に、10マイクロリットルの9-アミノアクリジンマトリックス溶液をクロロホルム中のペレットに加える。
ピペットと分散を繰り返して混合する。脂質とクロロホルムと9-アミノアクリジンマトリックス溶液とを含む溶液を16,000倍Gで30秒間スピンする。最後に、分析対象のMALDIターゲット上に上清を0.35マイクロリットルの液滴として堆積させ、液滴を少なくとも10〜15分間空気乾燥させる。
脂質分析の場合は、MALDI-TOF質量分析計でサンプルの質量スペクトルを3連で取得します。脂質標準物質による校正後、分析をマイナスイオンモードに設定し、小分子分析用に検出質量対電荷比範囲を200トムソンから2,000トムソンまで最適化します。レーザーフルエンスをスレッショルドより5%高く保ち、良好な信号対雑音比を維持します。
各マススペクトルに対して、平均2,000回のレーザーショットを1回適用します。遅延パルス抽出を使用してリフレクタモードでスペクトルを取得します。ゲート付きマトリックス懸濁液を400トムソンに塗布して、検出器の飽和を防ぎます。
この図は、TAFAZIN遺伝子の欠損が、カルジオリピン指紋における成熟カルジオリピン形態の減少とともに、モノリゾカルジオリピンおよび未熟カルジオリピン形態の出現によって示されるバース症候群に特異的な脂質プロファイルを典型的に決定することを示す。さらに、この図は、対照被験者の白血球のMALDI−TOF/MS分析が、典型的には2種の成熟カルジオリピンのみを示すことも示している。図は、バース症候群患者に対するモノリソカルジオリピン+未熟カルジオリピン比率が健常者および心不全患者よりも高かったことを示している。
ここで、対照群とバルト症候群患者とは1桁以上離れており、この方法がバルト症候群に対して強い診断能力を有することを示している。良好なアッセイ結果を確実に得るためには、白血球単離からモノリソカルジオリピン対カルジオリピン比計算までのすべてのプロトコルステップを注意深く踏襲することが重要です。MALDI−TOF質量分析は、脂質バイオマーカーまたは病理学的変化を同定するために、少量の様々な生物学的試料の脂質プロファイルを取得するのに有用である。
