שיטה זו מייצרת הדפסת אצבע קרדיוליפינית של לויקוציטים על ידי ספקטרומטריית מסה MALDI-TOF ומאפשרת מדידה של היחס בין מונוליסוקרדיוליפין לקרדיולפין לאבחון מהיר של תסמונת בארת. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא זיהוי של מינים שומנים אבחון על ידי סיבוב אחד של ספקטרומטריית מסה מיד לאחר בידוד של לויקוציטים ממילילטר אחד של דם. אלה והרגישות והספציפיות של העיניים הופכים את הבדיקה הזו לבדיקה אבחנתית מתאימה שתשתלב בעבודה השגרתית של מעבדות קליניות לבדיקת תסמונת בארת.
התחילו בהנחת דגימות דם על שייקר מסלולי למשך 10 דקות. לאחר מכן, כדי 0.9 מיליליטרים של דם שלם בצינור 1.5 מיליליטר, להוסיף 0.1 מיליליטר של 20% dextran. כעת מקטרים ומפזרים את המתלים בעדינות 20 פעמים תוך הימנעות מבועות אוויר ומניחים ל-RBCs משקעים במשך כשעה בטמפרטורת החדר.
באמצעות מזרק, לאסוף ולהעביר את הסופרנאטנט הצהוב לצינור 15 מיליליטר ולאחר מכן צנטריפוגה ב 400 פעמים G במשך 15 דקות בטמפרטורת החדר. לאחר השלכת הסופרנטנט, יש להחיות את הכדור המכיל בעיקר לויקוציטים ושאריות RBCs ב-0.6 מיליליטר של מים מזוקקים כפולים קרים כקרח. לאחר כ-15 שניות, הוסיפו 0.2 מיליליטרים של 0.6 אשלגן כלורי טוחן לתרחיף התא כדי לשחזר את האוסמולריות הנכונה.
ההלם האוסמוטי הקצר ישקר את RBC וישאיר את הלויקוציטים שלמים. לאחר מכן התאם את הנפח הסופי ל- 2.5 מיליליטר עם PBS בעל חוזק יחיד. לאחר מכן, צנטריפוגה המתלים ב 400 פעמים G במשך 15 דקות בטמפרטורת החדר.
לאחר מכן השלכת הסופרנטנט ושטיפה מחדש של גלולת הלויקוציטים עם 2.5 מיליליטרים של PBS בעל חוזק יחיד. חזור על צנטריפוגה והשליך את הסופרנאטנט כפי שתואר קודם לכן ובצע החייאה של הכדור המכיל לויקוציטים ב -200 מיקרוליטרים של מים מזוקקים כפולים מעוקרים. להקפיא את המתלים במינוס 80 מעלות צלזיוס או לבצע ישירות מיצוי שומנים.
התחל את המיצוי על ידי העברת 20 מיקרוליטרים של תרחיף לויקוציטים לצינור 1.5 מיליליטר וסובב ב 16, 000 פעמים G במשך 30 שניות. לאחר השלכת הסופרנטנט, מוסיפים 10 מיקרוליטרים של כלורופורם לכדור הנותר ושוב פיפטה כדי לקדם מיצוי שומנים. כעת, הוסיפו 10 מיקרוליטרים של תמיסת מטריצת 9-אמינואקרידין לכדורית בכלורופורם.
פיפטה ומפזרים שוב ושוב כדי לערבב. סובבו את התמיסה המכילה שומנים ותמיסת כלורופורם ומטריצת אמינואקרידין 9 ב-16, 000 פעמים G למשך 30 שניות. לבסוף, הפקידו את ה-supernatant כטיפות של 0.35 מיקרוליטרים על יעד ה-MALDI שיש לנתח ולתת לטיפות להתייבש לפחות למשך 10 עד 15 דקות.
לצורך ניתוח שומנים, רכשו ספקטרום מסה של דגימות בטריפליקטים על ספקטרומטר מסה MALDI-TOF. לאחר הכיול בתקני השומנים, הגדר את הניתוחים במצב היונים השליליים וייעל את טווח יחס המסה-מטען לגילוי מ-200 תומסון ל-2, 000 תומסון לניתוח מולקולות קטנות. שמור על פלואנס הלייזר 5% מעל הסף כדי לקבל יחס אות לרעש טוב.
עבור כל ספקטרום מסה, החל בממוצע 2, 000 צילומי לייזר בודדים. לרכוש ספקטרום במצב רפלקטור באמצעות מיצוי פועם מושהה. החל מתלה מטריצה מגודרת על 400 תומסון כדי למנוע רוויית גלאי.
האיור מראה כי הפגמים בגן TAFAZZIN קובעים בדרך כלל פרופיל שומנים ספציפי לתסמונת בארת המצוין על ידי הופעת צורות מונוליסוקרדיוליפין וקרדיולפין לא בוגרות יחד עם הפחתת צורות קרדיולפין בוגרות בטביעת האצבע הקרדיוליפינית. יתר על כן, האיור מראה גם כי ניתוחי MALDI-TOF/MS של לויקוציטים של נבדקי ביקורת מציגים בדרך כלל רק שני מינים של קרדיולפין בוגר. האיור מראה כי מונוליזוקרדיוליפין בתוספת קרדיוליפין לא בוגר על יחס קרדיולפין בוגר לחולי תסמונת בארת היה גבוה יותר מאשר עבור נבדקים בריאים וחולי אי ספיקת לב.
כאן, קבוצות הביקורת וחולי תסמונת בארת מופרדים על ידי יותר מסדר גודל אחד, ומראים כי לשיטה זו יש יכולת אבחון חזקה לתסמונת בארת. כדי להבטיח תוצאת בדיקה טובה, חיוני לעקוב בקפידה אחר כל שלבי הפרוטוקול מבידוד הלויקוציטים ועד לחישוב היחס בין מונוליזוקרדיוליפין לקרדיוליפין. ספקטרומטריית מסה MALDI-TOF שימושית להשגת פרופילי שומנים של כמויות קטנות של דגימות ביולוגיות שונות כדי לזהות סמנים ביולוגיים של שומנים או שינויים פתולוגיים.
