Bu yöntem, MALDI-TOF kütle spektrometresi ile lökositlerin kardiyolipin parmak izini oluşturur ve Barth sendromunun hızlı teşhisi için monolizokardiyolipin ve kardiyolipin arasındaki oranın ölçülmesine izin verir. Bu tekniğin temel avantajı, lökositlerin bir mililitre kandan izole edilmesinden hemen sonra tanısal lipit türlerinin tek bir kütle spektrometresi turu ile tespit edilmesidir. Bunlar ve göz duyarlılığı ve özgüllüğü, bu tahlili Barth sendromunu taramak için klinik laboratuvarların rutin çalışmalarına entegre edilecek uygun bir tanı testi haline getirmektedir.
Kan örneklerini 10 dakika boyunca yörüngesel bir çalkalayıcıya yerleştirerek başlayın. Daha sonra, 1.5 mililitrelik bir tüpte 0.9 mililitre tam kana, 0.1 mililitre% 20dekstran ekleyin. Şimdi pipet ve hava kabarcıklarından kaçınırken süspansiyonu nazikçe 20 kez dağıtın ve RBC'lerin oda sıcaklığında yaklaşık bir saat tortu bırakmasına izin verin.
Bir şırınga kullanarak, sarı süpernatantı toplayın ve 15 mililitrelik bir tüpe aktarın ve daha sonra oda sıcaklığında 15 dakika boyunca 400 kez G'de santrifüj yapın. Süpernatanı attıktan sonra, esas olarak lökositler ve artık RBC'ler içeren peleti 0.6 mililitre buz gibi soğuk çift damıtılmış suda yeniden askıya alın. Yaklaşık 15 saniye sonra, doğru ozmolariteyi geri kazanmak için hücre süspansiyonuna 0.2 mililitre 0.6 molar potasyum klorür ekleyin.
Kısa ozmotik şok RBC'yi lize edecek ve lökositleri sağlam bırakacaktır. Ardından, son ses seviyesini tek mukavemetli PBS ile 2,5 mililitreye ayarlayın. Daha sonra, süspansiyonu oda sıcaklığında 15 dakika boyunca 400 kez G'de santrifüj yapın.
Bunu, süpernatantın atılması ve lökosit peletinin 2.5 mililitre tek mukavemetli PBS ile yeniden yıkanması izler. Santrifüjü tekrarlayın ve süpernatantı daha önce tarif edildiği gibi atın ve lökosit içeren peleti 200 mikrolitre sterilize edilmiş çift damıtılmış suda yeniden askıya alın. Süspansiyonu eksi 80 santigrat derecede dondurun veya doğrudan lipit ekstraksiyonu gerçekleştirin.
20 mikrolitre lökosit süspansiyonunu 1.5 mililitrelik bir tüpe aktararak ekstraksiyona başlayın ve 30 saniye boyunca 16.000 kez G'de döndürün. Süpernatanı attıktan sonra, kalan pelete 10 mikrolitre kloroform ekleyin ve lipit ekstraksiyonunu teşvik etmek için tekrar tekrar pipet ekleyin. Şimdi, kloroformdaki pelete 10 mikrolitre 9-aminoakridin matris çözeltisi ekleyin.
Pipet ve karıştırmak için tekrar tekrar dağıtın. Lipitler ve kloroform ve 9-aminoakridin matris çözeltisi içeren çözeltiyi 30 saniye boyunca 16.000 kez G'de döndürün. Son olarak, süpernatantı analiz edilecek MALDI hedefine 0.35 mikrolitrelik damlacıklar halinde koyun ve damlacıkların havasının en az 10 ila 15 dakika kurumasını bekleyin.
Lipid analizi için, bir MALDI-TOF kütle spektrometresinde üçlü olarak numunelerin kütle spektrumlarını elde edin. Lipid standartlarıyla kalibrasyondan sonra, analizleri negatif iyon modunda ayarlayın ve küçük molekül analizi için 200 thomson ile 2.000 thomson arasındaki algılama kütle-yük oranı aralığını optimize edin. İyi bir sinyal-gürültü oranına sahip olmak için lazer akıcılığını eşiğin% 5 üzerinde tutun.
Her kütle spektrumu için ortalama 2.000 tek lazer atışı uygulayın. Gecikmeli darbeli ekstraksiyonu kullanarak reflektör modunda spektrum elde edin. Dedektör doygunluğunu önlemek için 400 thomson'a kapılı matris süspansiyonu uygulayın.
Şekil, TAFAZZIN genindeki kusurların tipik olarak, monolizokardiyolipin ve olgunlaşmamış kardiyolipin formlarının ortaya çıkmasıyla belirtilen Barth sendromuna özgü bir lipit profilini belirlediğini ve kardiyolipin parmak izindeki olgun kardiyolipin formlarının azaltılmasını göstermektedir. Ayrıca, şekil ayrıca, kontrol deneklerinin lökositlerinin MALDI-TOF / MS analizlerinin tipik olarak sadece iki tür olgun kardiyolipin sergilediğini göstermektedir. Şekil, Barth sendromlu hastalar için olgun kardiyolipin oranında monolizokardiyolipin artı olgunlaşmamış kardiyolipinin sağlıklı deneklerden ve kalp yetmezliği hastalarına göre daha yüksek olduğunu göstermektedir.
Burada, kontrol grupları ve Barth sendromu hastaları birden fazla büyüklük sırasına göre ayrılır ve bu yöntemin Barth sendromu için güçlü bir tanı yeteneğine sahip olduğunu gösterir. İyi bir tahlil sonucu elde etmek için, lökosit izolasyonundan monolizokardiyolipin-kardiyolipin oranı hesaplamasına kadar tüm protokol adımlarını dikkatlice takip etmek çok önemlidir. MALDI-TOF kütle spektrometresi, lipid biyobelirteçlerini veya patolojik değişiklikleri tanımlamak için az miktarda çeşitli biyolojik örneklerin lipit profillerinin elde edilmesinde yararlıdır.
