Bu yöntem, intravital hücre altı mikroskopi kullanılarak canlı hayvanda nötrofil göçü sırasında zarın yeniden şekillenmesini incelemek için bir tekniği açıklar. Bu protokol, fiziksel koşullar altında hayvan göçü sırasında membran dinamiklerini incelemek ve doku mikro çevresini dahil etmek için benzersiz bir yaklaşım sağlar. Bu teknik, farklı hücre tiplerinde ve göçmen hücrelerde zarın yeniden şekillenmesi ve hücre iskeleti dinamik organının yeniden konumlandırılması ve zar kaçakçılığını ele almak için uyarlanabilir.
Başlamak için, yeşil floresan boyayı, 1.5 mililitre BSA kaplı tüpte vahşi tip fareden saflaştırılmış nötrofil süspansiyonuna ekleyin. Bir tüp döndürücüde hafif çalkalama altında oda sıcaklığında 30 dakika inkübe edin. HBSS kullanarak üç yıkama yapın, ardından oda sıcaklığında beş dakika boyunca 400 kez G'de santrifüjleyin ve peleti bir mililitre Hanks'in Dengeli Tuz Çözeltisi içinde yeniden süspanse edin.
Bu süspansiyonu, enjeksiyon prosedürüne kadar hafif çalkalama altında bir tüp döndürücüde BSA kaplı tüpe yerleştirin. Enjeksiyondan önce, 20 mikrolitre başına 2 milyon ila 5 milyon hücre yoğunluğuna ulaşmak için hücre peletini tuzlu su çözeltisi içinde yeniden süspanse edin. Anestezi uygulanmış hayvanı, vücut ısısını korumak için 37 santigrat dereceye sahip bir ısıtma pedine aktarın.
Pençe çekme refleksini test ettikten sonra, görüntü kalitesini optimize etmek için ince bir düzeltici kullanarak kulaktaki tüyleri alın. Hayvanı yan yatırın, kulağın kenarını tutun ve cerrahi bandı kullanarak ısıtma pedi boyunca düzleştirin, ardından 33 gauge iğne ile donatılmış bir şırıngayı nötrofil süspansiyonu ile doldurun ve bir mikromanipülatöre monte edin. İğneyi yavaşça kulağa doğru hareket ettirin ve cildi yavaşça delin.
İğne cildin içine girdikten sonra, pistonu yavaşça itin ve iki ila üç mikrolitre hücre süspansiyonu verin. Enjeksiyonu kulağın iki ila üç farklı bölgesi için dikkatlice tekrarladıktan sonra, cerrahi bandı dikkatlice çıkarın ve hayvanın gözetim altında bilincini geri kazanmasına izin verin. Doku ve hücrelerin enjeksiyon prosedüründen sonra iyileşmesine izin vermek için görüntülemeden önce hayvanın bir saat dinlenmesine izin verin.
Anestezi uygulanmış hayvanı mikroskop sahnesine yerleştirmeden önce mikroskobun açık olduğundan ve tabla ile lenslerin 37 santigrat dereceye kadar önceden ısıtıldığından emin olun. Sahnedeki deliği bir cam lamel ile kapatın. Anestezi uygulanmış hayvanı dikkatlice sahneye taşıyın.
Görüntüleme bir saatten fazla planlanıyorsa, oftalmik merhem uygulayın ve kanatlı infüzyon bazlı perfüzyon sistemini sabitleyin. Lamelin ortasına bir damla salin damlatın ve nötrofil enjekte edilen kulağı üzerine yerleştirin. Hava ceplerini çıkarmak için lamel ortası boyunca steril bir pamuklu çubuk kullanarak kulağı nazikçe düzleştirin.
Kulağın yan tarafına hayvanın kafasına daha yakın olan tahta bir çubuğu hafifçe bastırarak ve bantla kilitleyerek kulağı sabitleyin. Ardından mikroskop merceğini kullanarak bir ilgi alanı bulun ve çoklu foton toplama moduna geçin. Yeşil floresan boya, mTomato ve kollajen-I'in aynı anda elde edilmesini sağlamak için lazer uyarma dalga boyunu 900 ila 930 nanometreye ayarlayın.
Ardından, yayılan ışığı toplamak için dedektörlere uygun ayna setini ve filtre kombinasyonlarını ayarlayın. Donanım yapılandırmasına en uygun ayarı belirleyin. Göç eden hücreler 30 saniye ila bir dakikalık aralıklarla izlenebilse bile, hücre altı olayları en az on saniyeden daha kısa aralıklarla daha yüksek bir hızda görüntüleyin.
Klasik intravital mikroskopi yaklaşımında, hücre göçünü izlemek ve konakçı fare dokusunu araştırmak için 512 x 512 piksel görüntü boyutuna sahip bir 30X lens ve bir Galvo tarayıcı kullanın ve her 30 saniyede bir 30 mikrometre derinliğinde bir hacmin görüntülenmesine izin vermek için iki mikrometrelik bir adım boyutuna sahip motorlu aşamayı kullanarak Z ekseni yer değiştirmesini ayarlayın. İntravital hücre altı mikroskopi yaklaşımında, son derece dinamik membran yeniden şekillenmesini daha yüksek bir büyütme ve çözünürlükte görüntülemek için ortalama üç kez 40X lens ve bir rezonans tarayıcı kullanın. Ayrıca, her dört ila beş saniyede bir 20 mikrometre derinliğinde hacim görüntülemeye izin vererek, bir mikrometre adım boyutuna sahip bir piezo kullanarak Z ekseni yer değiştirmesini ayarlayın.
Yüksek güçlü bir uyarma lazerini 10 saniye boyunca 20 x 20 mikrometrelik dar bir alana odaklayarak nötrofil göçünü tetiklemek için steril bir lazer yaralanmasına neden olun. Lazerin neden olduğu yaralanmayı, tüm kanallarda görünen güçlü otofloresan sinyalleri ve bunun sonucunda ortaya çıkan kollajen düzenlemesindeki değişiklikle tanımlayın. Daha fazla analiz için deneyin sonunda verileri kaydedin.
Alıcı fare, intravital mikroskopi tabanlı bir yaklaşımla kulak dokusundaki kan damarları, yerleşik hücreler ve saç folikülleri gibi yapısal özelliklerin görselleştirilmesini sağladı. Lazere bağlı yaralanmalar, tüm kanallarda tespit edilen güçlü otofloresansları ve kollajen düzenindeki değişiklikler nedeniyle kolayca görüntülendi. Derinin üç boyutlu mimarisinin ve enjekte edilen nötrofillerin lokalizasyonunun tam bir görünümü, üç boyutlu bir hacim oluşturmada cildin dış katmanlarından iç katmanlarına doğru bir Z yığınını tasvir eder.
Hızlandırılmış görüntüleme, kulak derisini örnekleyen ve hücre içi matriks ve konak doku ile etkileşime giren nötrofilleri gösterdi. İntravital hücre altı mikroskopi kullanılarak, göç sırasında plazma zarının dinamik olarak yeniden şekillenmesi, ön kenarda zar çıkıntılarının oluşumu ve hücrelerin arkasının geri çekilmesi açıkça görselleştirilir. Hızlandırılmış diziler, hücre içi matris ile etkileşimlerin karmaşıklığını ortaya koymaktadır.
Plazma zarının yerel dinamikleri, hücre yüzeyinin altında yatan 100 sınır noktasının tanımlanmasına dayanan bir algoritma hattı kullanılarak analiz edildi. Yerel eğrilik ve plazma zarı çıkıntılarının altını çizdiği alandaki değişiklikler her bir sınır noktası için hesaplandı ve her zaman dilimi için kimografi olarak raporlandı. Hücrelerin hem önü hem de arkası, hücrelerin yan tarafına göre daha yüksek eğriliği korur.
Negatif alan değişiklikleri, hücrelerin arkasında, pozitif alan değişikliklerinin daha belirgin olduğu ön kenara göre daha belirgindir. Görüntülemeyi takiben, ilgilenilen hedefi daha fazla değerlendirmek ve mekanizmaları aydınlatmak için doku toplanabilir, sabitlenebilir ve boyama için işlenebilir. Zar dinamiklerini görüntülemek için tasarlanan bu prosedür, farklı hücre tiplerinde ve kendi ortamlarında göç eden hücrelerde daha geniş hücre biyolojisi sorusunu ele alacak şekilde uyarlanabilir.
